생명과학실험1 SDS-PAGE & Coomassie blue Staining

소개

"생명과학실험1 SDS-PAGE & Coomassie blue Staining"에 대한 내용입니다.

목차

I. Introduction
1. SDS의 역할 및 원리
2. Gel에 들어가는 시료의 역할
3. Resolving, stacking gel의 차이
4. Coomassie blue

II. Materials

III. Method

IV. Result
1. Dokdo marker, gel 사진
2. 정제하고자 했던 단백질 AP의 band 위치 표시
3. 결과 관찰 내용

V. Discussion
1. 정제 전보다 정제 후 AP의 순도(전체 단백질 밴드 중 AP band의 intensity 비율)는 높아졌는가? 그렇다면, 어떤 농도의 용액에서 가장 높아졌는가? 만약 정제 후 순도가 높아지지 않았다면 무엇이 문제일 수 있는가?
2. 정제 하고자 하는 단백질 외의 band가 존재하는 이유는?

본문내용

1. SDS의 역할 및 원리

SDS(sodium dodecyl sulfate)는 계면활성제의 일종으로 단백질이나 핵산의 구조를 깨뜨려 선형으로 만들어주는 역할을 한다. 아미노산의 소수성 부분과 hydrophobic interaction을 하며 결합하는데, 아미노산 2개당 1개 정도 binding하여 단백질을 변성한다.

2. Gel에 들어가는 시료의 역할

① Tris-HCl: Stacking gel과 Resolving gel의 pH를 다르게 하여 각 gel에서 Glycine의 charge 다르게 조정해준다. 또한 Cl-를 첨가해주어서 이후 전기영동에서 전기를 걸어줄 때 중요한 역할을 하게끔 해준다.
② SDS: 아미노산 2개에 하나씩 결합해 비공유 결합을 저해시켜 단백질을 변성시키며, 모든 단백질에 (-) masking을 걸어 전극을 걸었을 때 단백질들이 (+)를 향해 이동할 수 있게 한다.
③ APS: acrylamide의 교차연결을 촉매하며, 반응의 Initiator이다. 따라서 라디칼의 개시 물질이기 때문에 실험 사용시 만든다.
④ TEMED: APS의 중간체를 안정화시키는 Catalyst이다. free radical을 형성하게 함으로써 gel의 형성을 촉매한다.

3. Resolving, stacking gel의 차이

Resolving gel과 Stacking gel는 pH가 다르고, 이에따라 다른 역할을 한다. 먼저 stacking gel은 시료가 같은 위치에서 전기영동을 시작할 수 있도록 한다. glycine 이온은 pl값이 6으로, pH가 6.8인 stacking gel에서 net charge가 0에 가깝다. mobility는 Cl이온, 단백질, glycine순서로 크다. 따라서 protein이 glycine과 Cl이온 사이에 갇혀있게끔 만든다. 이 과정을 통해 시료가 같은 위치에서 전기영동을 시작 할 수 있도록 한다.
Resolving gel은 pH가 8.8이다.

참고자료

· 레닌저 생화학 6판