9주차_DNA digestion and gel extraction

목차

I. Purpose

II. Theory
1. 제한효소(Restriction enzyme)
2. Restriction digest의 원리
3. Gel extraction의 원리

III. Apparatus/reagent

IV. Procedure
1. DNA Digestion
2. Insert cut preparation
3. PCR Clean-up (NucleoGen PCR/Gel Combo Kit protocol)
4. Gel Extraction

V. Data&Results
1. DNA digestion
2. PCR clean-up
3. Gel-extraction
4. Digestion하지 않은 plasmid sample

VI. Discussion

본문내용

Purpose: 제한효소를 이용해 플라스미드 DNA를 절단하고, 젤에서 절단한 DNA를 추출한다.

Theory
1. 제한효소(Restriction enzyme)
(1) 역할
제한 효소는 RNase, DNase 또는 Restrictase라고 부르는 효소로 DNA의 특정 인식 위치인 (restriction site)를 인식해서 절단하기 때문에 넓은 의미에서 endonuclease에 속한다. bacteria나 archaea에서 바이러스 침입의 방어 메커니즘으로 존재하는데, prokaryote의 경우 제한 효소는 외부 DNA만을 선택적으로 잘라서 restriction digestion을 한다. 이 과정 동안 host DNA는 modification enzyme인 methyltransferase에 의해 변형되기 때문에 절단으로부 터 보호된다. 이러한 효소들은 DNA modification과 molecular cloning에서 매우 중요한 tool 로 사용되고 있다. 지금까지 3600개 이상의 restriction endonuclease가 알려졌으며, 그중 3000개 가량이 연구 중이고, 800개 이상은 상업적으로 사용되고 있다. 제한 효소는 동일 조 상으로부터 horizontal gene transfer을 통해 전달된 것으로 추정된다.
제한 효소의 역할은 DNA의 특정 지점을 인식하고, 절단하는 것이다. 제한 효소의 인식 지 점은 일반적으로 4~8bp에 해당하며, 염기가 4종류이므로 4 n bp에 한 번씩 인식 지점이 존재 한다고 할 수 있다. 인식 서열은 많은 경우 5’에서 3’방향, 3’에서 5’방향이 동일한 회문 구조 (palindromic)를 갖는다. 제한 효소에 DNA가 절단되면 sticky end(점착성 말단)과 blunt end (비점착성 말단)이 생성될 수 있다. 점착성 말단은 EcoRⅠ에 의해 잘렸을 때 관찰할 수 있는 말단으로, DNA가 엇갈려서 잘렸기 때문에..

<중 략>

참고자료

· styer, biochemistry. 7th, freeman, 2012, pp153-161