[미생물학실습] PCR 프라이머 디자인

소개

미생물학실습 클로닝 실험의 일환인 프라이머 디자인을 주제로 한 과제입니다. 프라이머 디자인의 순서, 관련 웹사이트 사용법, 충족해야할 조건의 리스트를 알아보실 수 있습니다. 본 문서는 결과 리포트를 포함하지 않습니다.

과제 수행 시 세부 조건은 다음과 같았습니다. 참고하셔서 원하는 조건에 맞추어 적용하시면 되겠습니다.
- 추후 클로닝을 위해 5’ XhoI / 3’ XbaI 제한효소 염기서열을 넣을 것 (6 bp extra sequence 포함)
- 최종 PCR product는 500 ~ 1000 bp

primer BLAST 결과 링크가 비어있는 페이지로 연결되나 이는 오류가 아니며 BLAST를 실행한 지 일정 시간이 지났기 때문입니다. 화면 캡쳐된 이미지를 보시고 BLAST 결과를 확인하시면 됩니다.

목차

1. PCR primer desgin 가이드라인 (팀플조원에게 공유하기 위한 용도로 제작한 가이드라인입니다)
2. 프라이머 디자인 과정 (실제 과제 제출본입니다)

본문내용

1. Pubmed에 접속해서 논문에서 사용한 프라이머 서열을 구한다
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/
검색어: RAW 264.7 primer sequence NOT RT-PCR
검색 결과에서 RT-PCR가 포함된 논문은 제외한다. real time PCR을 하는 경우
PCR product가 100~200 bp 가 되는데, 이렇게 적게 디자인하면 클로닝이 힘들기 때문이다.
무료 공개가 되지 않는 논문은 대학교 이메일 사용하면 액세스 된다.

2. Primer BLAST에 접속해서 PCR product의 크기를 예상한다
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi
Primer Parameters에서 논문에서 찾은 프라이머 서열을 입력한다
Use my own forward primer (5'->3' on plus strand)
Use my own reverse primer (5'->3' on minus strand)
Organism에서 Homo sapiens라고 써있는데 지우고 Mus musculus라고 입력한다. 디폴트 값과 다른 정보를 입력했기 때문에 노란색으로 하이라이트 처리되는 것이 정상이다.
검색 결과가 나올 때까지 대기한다. 시간이 조금 걸린다.

3. Primer BLAST results를 본다
PCR product가 500~1000bp 사이로 나왔는지 확인한다
프라이머가 hair pin 구조를 만들 가능성이 있는지 확인한다 (Self-complementary sequence)

Exonuclease
1. forward 프라이머의 5’ 서열 맨 앞에 5’-CTCGAG-3’ (Xho1)를 추가한다

참고자료

· Anti-inflammatory activity of brown alga Dictyota dichotoma in murine macrophage RAW 264.7 cells
· https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
· https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
· Thermo Fischer Tm calculator
· Restriction Mapper