GFP 단백질과 단백질 정량 A

소개

"GFP 단백질과 단백질 정량 A"에 대한 내용입니다.

목차

Ⅰ. Abstract
Ⅱ. Introduction
III. Materials & Methods
Ⅳ. Results
Ⅴ. Discussion
Ⅵ. Reference

본문내용

Ⅰ. Abstract
EGFP는 녹색형광단백질이고, 488nm 파장에서 excitation max를 가지고있는 단백질이다. EGFP 질량 농도를 측정하기 위해서는 단백질 정량 방법 중에서, Lowry assay 그리고 Extinction coefficient assay를 사용해 정량할 수 있고, 두가지의 결과 값을 비교하였다.
처음 실험인 Lowry assay는, Biuret reaction 그리고 Folin reaction을 합한 과정으로 이루어진 방식이다. 이때 Folin reaction까지 마치게되면, 진한 파란색을 띄게된다. 이러한 Lowry assay에서는 표준곡선이 사용되는데, 이때 표준으로 설정된 단백질이 존재하게 된다. 이번 실험에선, 소에 혈청에서 분리된 단백질인 BSA가 일반적으로 표준 단백질로 사용된다. 6개의 well plate에 DIW 그리고 BSA의 비율을 달리해서 넣어준후, 750nm 파장에서 흡광도를 측정해 표준 곡선을 그리고, 추세선과 단백질 농도 관계식을 이용해 EGFP의 질량 농도를 측정하였다. 최종적으로 이를 통해 계산하면 1.625mg/mL 값을 구할 수 있다.
두 번째로는 Extinction coefficient assay로 특정한 아미노산이 가지는 흡광도 그리고 특정 단백질의 3차구조가 가지는 흡광도를 이용해 단백질 농도를 측정하는 것이다. PBS와 EGFP를 섞어서 488nm에서의 흡광도를 측정한후, Lambert-Beer's Law 공식에 대입해 몰농도를 구하고 EGFP의 질량 농도를 계산해 0.849mg/mL 값을 구할 수 있었다.
실험의 결과적으로는, 약 0.776mg/mL의 차이가 존재하였다. 그 원인으로는, 두 측정 방식에서 기인한 차이라고 결론지었다. 정확도를 높이기 위해서는, 파이펫팅을 통한 용액 혼합을 제대로 실시하여 잘 섞이게 하고, 세게 하여 용액이 밖으로 튀지 않도록 해야한다.

참고자료

· Reece, Taylor. Simon, (2011), Campbell Biology, 7th Edition, Pearson, pp. 43-45
· Daniel C. Harris(2016), Quantitative Chemical Analysis, 9th edition, W.H. Freedman, pp. 477-485
· Kreader CA (March 1996), "Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein". Applied and Environmental Microbiology. 62 (3):1102– 6. PMC 167874. PMID 8975603
· Allan J. Tobin and Jennie Dusheck (2005), Asking About Life, 3 edition, Brooks/Cole, pp. 59-61