RT-PCR - 예비실험보고서

목차

1. 실험 제목
2. 실험 목적
3. 실험 원리

본문내용

실험 제목
RT-PCR

실험 목적
지난주에 isolation 했던 RNA를 이용하여 cDNA를 만드는 역전사 과정을 수행하여 원하는 target의 양을 PCR로 확인한다.

실험 원리
RT-PCR
DNA 에서는 exon과 intron이 있으므로 DNA를 template로 하는 경우에는 exon과 intron이 모두 증폭될 수 있다. 하지만 intron은 exon에 비해서 매우 크기 때문에 exon 중에 몇 개를 한꺼번에 증폭하려면 DNA로는 힘들다. 더구나 intron sequence는 일부를 제외하고는 중요성이 떨어진다고 인식되어 밝히지 않은 것이 많아 GenBank에서도 찾을 수 없는 경우가 많다. 이러한 이유 때문에 mRNA를 template로 해서 PCR하는 방법을 RT-PCR(Reverase Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)이라고 합니다. 이 경우는 앞에서 설명한 PCR을 시행하기 이전에 RNA로부터 DNA를 합성해 주는 효소(RNA-dependent DNA polymerase)인 reverse transcriptase를 처리한다.

맨 먼저 reverse transcriptase로 RNA를 complementary DNA(cDNA)로 역한다. 이때는 downstream primer만 사용하게 되는데 왜냐하면 RNA는 single strand이기 때문이다. 그 후 생성된 cDNA에서 일반적인 PCR의 과정을 밟아서 유전자를 증폭한다.

Oligo(dT) primer를 쓰면 분리한 RNA 중 mRNA는 모두 cDNA로 만들어진다. 그리고 Gene specific primer를 사용하면 target gene만 cDNA로 만들어지게 된다. 그리고 random primer를 넣고 반응시키면 길이도 다양하고 모든 RNA(rRNA, tRNA 포함)가 모두 cDNA로 만들어진다.

참고자료

· 미생물학실험서. 한국미생물학회. 을유문화사. 1998, pp485∼492.
· 생화학. D.L. Nelson, M.M. Cox 저. 박길홍 외 8인 역. 서울외국서적. 2002, pp136∼138, pp116
· 유전공학(제2판). J.D. Watson 외 3인 저. 박영순 외 5인 역. 탐구당. 2002, pp8 7∼93.