[생화학실험 A+ RNA 보고서] RNA extraction, cDNA synthesis, Real time PCR

소개

"[생화학실험 A+ RNA 보고서] RNA extraction, cDNA synthesis, Real time PCR"에 대한 내용입니다.

목차

1. Introduction
1) RNA and circRNA
2) RNA extraction
3) cDNA synthesis.
4) Real time PCR

2. Result
1) RNA extraction
2) cDNA synthesis
3) Real time PCR

3. Discussion

4. Reference

본문내용

이 과정에서 Chloroform의 역할은 pH를 조절하여 pH4 이하에서는 RNA만을 선택
적으로 추출할 수 있는 환경을 만들어주고, pH8에서는 RNA 뿐만 아니라 DNA도 안
정화하는 역할을 한다. 또한 RNA가 존재하는 수층에 잔존하는 phenol을 제거하는
역할도 하여 수층에 유기용매를 제거하는 역할을 한다. 상층액으로부터 모아진 pellet에 isopropanol을 첨가한다. 이 시약은 DNA와 RNA를
침전시키는 작용을 하는데, DNA, RNA isopropanol 용액에서 solubility가 낮다. 물에
서 soluble한 DNA와 RNA가 물보다 isopropanol의 양이 많아지면서 침전되게 된다. Precipitation을 진행하는 과정이 끝났다면, 70% ethanol로 이들을 washing 하는
과정을 거친다. 이때 침전시킨 DNA와 RNA가 물에 소량 녹을 것임에도 불구하고
70% ethanol을 사용한 이유는 침전물 사이 salt를 녹이기 위해서 물을 첨가해 주는
것이다. 이 건조된 RNA/DNA pellet은 물에 녹여져 TURBO DNase 처리를 하게 되는데, 이
는 이후에 진행될 DNA 분리과정에서 완전히 제거되지 않을 DNA와 그에 따른 오염
을 사전에 해결하기 위해 미리 DNase로 DNA의 5’ 말단을 비특이적으로 절단하여
oligodeoxynucleotide를 남기게 된다. 앞선 과정에서 acid phenol chloride를 사용하
여 바로 RNA을 추출하지 않고 RNA와 DNA만 따로 먼저 추출한 이유도 바로 이
DNase를 처리해주기 위함이다. 이후 Nano drop이라는 장비를 통해서 농도를 결정해주었는데, 결과 Table 1을 참
고하여보면, 농도는 650.4 ng/㎕로 이전에 예상한 2,000~2,500 ng/㎕ 보다 더 작은
값이었으나 A260/A280와 A260/A230 두 값이 모두 이상적인 범위 안에 포함되었다. A260/A280 ratio는 단백질 또는 salt가 완전히 제거되지 않았을 경우 또는 샘플이
오염 되었을 경우 1.8-2.1 범위보다 크게 측정된다.

참고자료

· Nature Communications, volume 11, 4812, (2020)
· Journal of Microbiological Methods, Volume 170, 105855, (2020)
· OncoTargets and Therapy, Volume 12 :8249-8261 (2019)
· https://www.britannica.com/science/reverse-transcriptase,
· https://www.genome.gov/genetics-glossary/RNA-Ribonucleic-Acid#:~:text=Ribonu
· cleic%20acid%20(RNA)%20is%20a,%2C%20or%20guanine%20(G).
· https://en.wikipedia.org/wiki/Circular_RNA
· https://blog.naver.com/bio0719/222149895530
· http://hpc.ilri.cgiar.org/beca/training/IMBB_2015/lectures/NanoDrop.pdf
· https://microbenotes.com/real-time-pcr-principle-process-markers-advantages-ap
· plications/
· https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/cloning/cloning-learningcenter/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzy
· mes/pcr-basics.html
· https://www.mun.ca/biology/scarr/PCR_simplified.html
· https://www.google.com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fwww.future-science.com
· %2Fdoi%2F10.2144%2F05391RV01&psig=AOvVaw1o7xcK8e97yNxxul4nuZeY&ust
· =1635494991899000&source=images&cd=vfe&ved=0CAwQjhxqFwoTCIDFz-fT7P
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· https://slideplayer.com/slide/13608052/
· https://www.zymoresearch.com/pages/what-is-trizol