qPCR(real-time PCR, RT PCR)

소개

"qPCR(real-time PCR, RT PCR)"에 대한 내용입니다.

목차

1. Date

2. Title

3. Object

4. Introduction
4.1. Real time PCR
4.2. Real time PCR standard

5. Material & Methods
5.1. Materials
5.2. Methods
5.3. qPCR condition

6. Results
6.1. Standard curve
6.2. qPCR 결과를 통한 initial sample(환경시료) 및 배양 sample 내 DNA 정량

7. Discussion
7.1. AOA 결과
7.2. AOB 결과
7.3. DNA extraction 결과와 비교

본문내용

1. Date : 21. 11. 08. 월
2. Title : 환경 샘플로부터 질산화 미생물 농화 배양 및 유전자 분석을 통한 계통 분류
3. Object : qPCR : quantitative PCR, Real time PCR

4. Introduction
4.1. Real time PCR
Real time PCR이란, PCR 산물의 증가를 형광물질을 이용하여 실시간으로 모니터링하여 증폭되는 산물을 정량할 수 있는 PCR 기법으로 quantitative PCR이라고도 불린다.1)
Real time PCR은 일반적인 PCR(conventional PCR)에서 이용하는 전기영동에 비해 민감도가 높고, 전기영동 과정을 생략함에 따른 오염의 위험이 적다는 장점이 있다.1)

4.1.1. SYBR 원리
DNA binding dye 중 대표적으로 사용되는 SYBR green은 PCR 반응 단계 중 denaturation 단계에서 single strand DNA로 분리된 상태에서는 결합하지 않는다. 그러나, extension 단계에서 DNA가 double strand로 합성될 경우 DNA에 결합하여 형광을 발하게 된다. 이 때, 발생하는 형광 강도를 측정함으로써 증폭되는 dsDNA의 양을 정량할 수 있다.2)
그러나, SYBR green의 경우 PCR 반응 중 나타날 수 있는 모든 dsDNA(ex_primer dimer, non-specific PCR product)에 결합하여 형광을 발할 수 있으므로, 추가적으로 melting curve를 분석하여 target만이 증폭되었는지 확인하는 과정을 거쳐야 한다.2)

4.1.2. Taqman probe 원리
Taqman probe란 primer와 비슷한 구조를 가진, 5‘ 말단에 형광물질인 reporter와 3’ 말단에 형광 상쇄물질인 quencher가 결합된 oligonucleotide이다.

참고자료

· Merck. Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods
· https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/quantitative-pcr-and-digital-pcr-detection-methods
· 네이버 블로그. 식품위생안전 전문기업 ㈜세니젠 기술연구소. Realtime PCR의 원리
· https://m.blog.naver.com/sanigen/221301552425
· ThermoFisher scientific. Real-Time PCR 학습센터. qPCR에 대한 절대 및 상대 정량 분석의 비교
· https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/absolute-vs-relative-quantification-real-time-pcr.html
· BIOSEARCHtm TECHNOLOGIES. “qPCR troubleshooting : interpreting amplifiction curves and diagnosing problems”. 2021
· http://blog.biosearchtech.com/thebiosearchtechblog/bid/63622/qpcr-troubleshooting
· “The Obligate qPCR standard Curve”. BiteSizeBio. Nov 17. 2016
· https://bitesizebio.com/31470/obligate-qpcr-standard-curve/
· Precision Health. “qPCR Analysis-Standard Curve Method” 06:46
· https://www.youtube.com/watch?v=nJoR0fhxpaA
· Xiangjun He, Guodong Ji, “Responses of AOA and AOB activity and DNA/cDNA community structure to allylthiourea exposure in the water level fluctuation zone soil”, Environ Sci Pollut Res Int(2020), 15233-15244