ferritin fusion protein expression 결과보고서(논문형) A+ 받은 자료입니다.

소개

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목차

1. stage1- Cell culture
2. stage2 - Isolation of plasmid DNA
3. stage3- Amplification of target genemFerritin(U2, U2L) by PCR
4. stage4- Restrictopn Enzyme digestion of PCR and plasmid DNA
5. stage5- Ligation of epitope-Ferritin DNA
6. stage6- E.coli Transformation
7. stage7- Screening of transformations by colony PCR
8. stage8- Expression of fusion gene by IPTG indauction
9. stage9- Identification of Recombinant DNA
10. stage10- Purification of fusion protein by metal affinity chromatography

본문내용

Cell culture

실험 목적 :
km항생제 저항을 가진 pET28a-SUMO/DH5a를 LB/KM plate에 streak 한후 생성된 colony를 LB/Km broth 에 접종한후 배양시킨다.

introduction
SUMO 벡터 사용한이유
우리는 T7 promoter로 단백질을 발현시킬건데 이pET 계열의 vector들은 모두 T7 promoter를 사용하기 때문에 이 vector를 사용하였고 후에 단백질 절단과 정제의 과정을 생각해서 6xHIS와 SUMO를 붙인 pET28a-SUMO vecter을 사용하였습니다.

실험방법
E. coli pET28a-SUMO/DH5alpha 접종
1) LB/Km에 pET28a plasmid가 들어간 E. coli DH5α를 접종하여 single colony를 얻는다2) LB/Km broth 30 ml에 pET28a-SUMO/DH5α single colony를 접종한다.
3) 37oC shaker에서 overnight culture하여 saturated growth되게 키운다 (16시간)

결과분석
LB/Km plate에 pET28a plasmid가 들어간 E.coli을 접종하면 Km에 의해 우리가 얻고 싶은 pET28a plasmid만 single colony로 얻을 수 있게 된다. 이 single colony를 LB/Km broth에 넣어서 배양하여 원하는 plasmid가 들어있는 E.coli를 대량으로 얻을수 있다.

Isolation of plasmid DNA(190402)

실험목적:
대량배양시킨 pET28a-SUMO/DH5a plasmid를 E.coli DH5alpha,cell에서 plasmid만 분리해내는 과정이다.

실험 방법
1. <Cell harvest> culture cell을 1.5 ㎖ eppendorf tube에 750㎕씩 두 번 넣고(총 1.5 ㎖), 12,000rpm/2분 centrifuge한다.

참고자료

· 없음