DNAprep & luciferase assay & Real time PCR

소개

A+받았던 레포트입니다
DNA prep, luciferase assay, Real time PCR 까지 한꺼번에 상세하게 작성한 레포트입니다

목차

1. Introduction
2. Meterial & Method
3. Result
4. Discussion
5. Reference

본문내용

Mini prep은 Plasmid DNA를 분리하는 방법을 말하는데 prep이라는 표현은 플라스미드 준비(plasmid preparation)나 플라스미드 추출(plasmid extraction)의 약자를 일컫는 말이다. 앞에 mini-가 붙었으므로 소량의 plasmid를 추출한다는 것을 의미하며 pH를 이용하여 DNA를 분리하기 때문에 Alkaline lysis method이다.
SDS와 NaOH가 들어간 용액은 두 가지 DNA변형을 일으키는데 chromosomal DNA변형이 plasmid DNA보다 더 크다. 세포벽을 온전하게 유지하는데 필수적인 calcium ion을 제거하는 EDTA를 이용하여 세포벽을 깨는데 이 때 glucose를 이용해 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시킨다. 실험과정에서 vortex를 사용하는데 이 때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA 가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA 와 구분할 수 없게 되므로 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨야한다. chromosomal DNA는 세포막에 결합된 상태로 남아있게 되고 원심분리로서 침전시켜 모을 수 있으며 plasmid DNA는 상층액에서 isopropanol로 침전시켜 분리할 수 있다.
그림과 같은 원리를 적용하기 위해서 실험에서는 3가지 종류의 시약을 사용한다. Solution 1(resuspension solution)에는 glucose, Tris-HCl, EDTA, RNase가 들어있고 solution 2(lysis solution)에는 NaOH와 1% SDS, solution3(neutralization solution)에는
[그림 ] Alkali lysis method의 원리
Potassium Acetate, Acetate가 들어있다.
Solution 1에서 EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는데 필수적인 ion을 제거하여 세포벽이 부분적으로 무너지게 한다. 이 때 Glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜주는 역할을 하는데 위에서 언급했듯이 chromosomal DNA와 plasmid를 구분하기 위해 세포를 유지시켜가며 세포벽만 깨야하므로 glucose를 이용한다.

참고자료

· http://dasan.sejong.ac.kr/~yjlee/3-3.htm
· https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=5569048&cid=61233&categoryId=61233
· https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=2691611&cid=60261&categoryId=60261
· https://m.blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=and9244&logNo=130185387085&proxyReferer=https%3A%2F%2Fwww.google.co.kr%2F
· Geoffrey M.Cooper, Robert E. Hausman, 『세포학 분자적접근』6판, 2015, 월드사이언스, p.129
· https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=5569270&cid=61233&categoryId=61233
· https://blog.naver.com/qwerty_0620/220875578751