생화학실험 PCR(Polymerase chain reaction) 자료

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2018.10.11
최종 저작일
2016.12
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본문내용

Ⅰ. 실험목적
· DNA중합효소 연쇄반응인 PCR(Polymerase Chain Reaction)의 원리에 대해 이해한다.
· PCR을 진행한 후 전기영동을 통해 증폭된 DNA를 확인한다.

개요
효소반응에서는 약간의 효소로 몇 번이고 반응을 반복하여 대량의 기질을 반응산물로 바꾸어간다. 유전자를 복제하는 DNA polymerase는 주형DNA와 3’-OH를 가진 primer가 없으면 반응이 진행되지 못한다. 따라서 몇 번이고 기질을 회전할 수 있는 반응으로 정해진 부분의 DNA를 증폭시키기 위해서는 이중가닥의 DNA를 단일가닥으로 분리하는 과정이 필요하며 그러기 위해서는 60~70℃의 고온이 필요하게 된다. 효소학의 상식에서는 DNA polymerase는 그러한 고온에서는 변성됨으로 반응을 회전시킬 수가 없는 것이라고 생각해 왔다. 그런데 70℃가까운 온천속에서 증식되는 세균이 발견되어 비로소 고온에도 견딜 수가 있는 DNA polymerase인 Taq polymerase가 분리되었다. 이 Taq polymerase의 출현으로 DNA의 일부분을 몇 번이고 반복하여 읽고 증폭하는 것이 가능하게 되었다. 이것이 Polymerase Chain Reaction(PCR)이다.

1. 정의
1985년 K.Mullis에 의해 고안된 PCR은 특정 DNA부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관 내에서 원하는 DNA 분자를 2n배로 증폭시키는 방법이다.
이론적으로는 무한정으로 증폭시킬 수 있지만 효소활성저하로 25~30회 정도 반복한다.

2. 반응 사이클
PCR반응은 우선 이중가닥의 DNA를 변성시키는 step 1, 다음에 primer라 불리는 특정 DNA의 Upstream과 downstream 영역의 특정 부의에 특이적으로 결합하는 두 종의 15~30 뉴클레오티드가 각각 template DNA에 결합하는(annealing) step 2, 그리고 그 primer의 3‘-OH에 template와 상보적인 염기를 가진 뉴클레오티드가 차례로 결합하는 중합반응의 step 3로 구성되어있다. 이 step 1, 2, 3를 반복함으로써 primer사이의 DNA를 2시간 정도 내에 100만 배까지 늘릴 수가 있다.

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