결과.단백질 전기영동과 Gel staining, western blotting

목차

1. 단백질 전기영동과 gel staining
2. 면역발색법 (Western blot)

본문내용

1. 면역 발색 결과를 첨부하고 결과를 분석하시오.
윗쪽의 이미지는 CK에 대한 면역발색 결과이다. 번갈아가며 MB,MT를 한쌍으로 모두 5개의 조가 실험 한 모습이다. MB에서는 대체적으로 CK가 많이 검출되지 않았고, MT에서 훨씬 많이 나타났다.
두번째 이미지는 actin에 대한 면역발색 결과이다. 마찬가지로 MB, MT 순으로 5조의 실험결과인데 MB, MT 둘 다 actin에 대해서는 반응이 잘 되었지만 MT가 조금 더 크게 검출 되었다.

2. Transfer를 한 후 transfer가 잘 되었는지 확인 할 수 있는 방법에 대해 서술하시오.
transfer를 하는 도중 거품이 발생하는 것이 눈으로 확인 된다면 정상적으로 transfer되고 있다는 의미이다.
transfer가 끝난 후 membrane에 단백질이 잘 붙었는지 확인 하기 위해 PonceauS stain을 해 본다.

3. 면역발색 결과 여러 band가 나왔다. 우리가 검출하기 위해 사용했던 항체가 인식하는 단백질과 다른 크기의 band는 어떻게 설명할 수 있을까? 또, 이것을 줄일 수 있는 방법에 대해 설명하시오.
항원 항체 반응에서, 항체는 보통 항원의 비교적 작은 영역을 인식하기 때문에 의외로 교차반응이 나타날 수 있고, 전혀 관계없는 단백질과 반응 할 수도 있다. 이런 문제들은 항체의 희석률, 특이성에서 기인하거나 전기영동에 쓰인 단백질 량이 너무 많은 경우, 혹은 block이 잘 되지 않았을 경우를 생각해볼 수 있다. 각 경우에 대하여 항체의 농도검정을 다시 측정해 보거나, 단백질량을 줄여보기, bloking을 overnight 해보는 것이 좋다.

4. 면역발색 결과 검출된 신호의 강도가 낮았다. 가능성 있는 원인은 무엇이고 해결방법을 생각하여 서술하시오.
이 역시 3번과 비슷한 원인이 있을 수 있다. 항체의 희석률이 잘 맞지 않거나, block이 약할 경우 혹은 항원으로 작용해야 할 단백질의 양이 적을 경우 등이 있다. 해결방법으로는 일,이차 항체의 농도 검정을 다시 해보고, blocking 시간을 늘리고 일차항체를 overnight으로 반응 시켜 본다. 또 단백질 양을 증가시킨 후 실험해 본다.

참고자료

· 단백질실험노트 상•하, 2006, 김승호 외1 역, 월드사이언스
· 레닌저 생화학, 2006, David L. Nelson, 백형환 역, 월드사이언스