Isolation of total RNA-1 in Brassica Rap

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Isolation of total RNA-1 in Brassica Rap 레포트

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Total RNA 추출 방법.

1 AGPC 법(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform)

시중에 여러 종류의 RNA 분리용 kit가 시판되고 있으며, 이러한 kit는 사용 방법이 간단하고 RNA 분리시간을 단축시킬 수 있다. 그러나 microcentrifuer tube 용량의 수준에서 추출하기 때문에 약간의 부주의로 분리․추출한 total RNA가 오염되기 쉽다. 순수한 RNA를 필요로 한다면, AGPC법을 이용하기 추천한다.
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2 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR)

PCR과 역전사반응을 조합하여서 RNA를 정성적 또는 정량적 검출하는 것이 가능하다. 일반적으로 RNA의 정성적, 정량적인 검출에는 Northern blot, dot blot, S1 map 등이 이용되고 있으나, 이 방법들은 몇 가지 불편한 점이 있다. 그것들은 probe의 필요성, 상당량의 RNA의 필요, 결과를 얻기까지 장시간의 요구, 발현양이 적을 경우 검출의 곤란 등이 있다. RT-PCR은 이러한 문제들을 해결하는 유용한 방법이다.
RT-PCR을 수행할 때 primer 사용에 따라서 3가지 방법이 있다. Oligo (dT), 특정 염기서열의 primer와 random primer를 이용할 수 있다.

<중 략>

1. PCR의 각 과정

(a) Denaturation
PCR의 가장 첫 단계이며, 온도가 높아짐에 따라 DNA의 염기 사이에 있는 수소결합이 끊어져 두 가닥의 DNA가 분리된다. 일반적으로 94℃ 정도에서 1분간 진행된다.

(b) Annealing
각각 두가닥으로 분리된 DNA molecule에 primer가 붙는 과정이다. Primer는 그들과 상보적인 염기를 가지고 있는 DNA 서열에 달라붙는다. 이 과정이 바로 PCR의 accuracy를 결정짓는 단계이며, 어느 온도로 진행되는 가는 primer의 길이와 그것을 이루고 있는 염기의 종류에 따라 달라진다. 만약에 온도가 너무 높으면 primer가 DNA molecule에 잘 달라붙지 않아 그 효율이 떨어지며, 반대로 온도가 너무 낮을 경우에는 primer가 mismatch할 확률이 높아서 정확도가 그만큼 더 떨어진다. 일반적으로 온도는 아래의 식에서 결정되며, 여기서 trial & error 과정을 포함하여 좀 더 구체적으로 결정한다.

참고자료

· http://chanjae.net/32
· http://cafe.naver.com/clontech.cafe?iframe_url=/ArticleRead.nhn%3Farticleid=16&
· http://agelf.blog.me/140016400157
· 분자생물학 입문서 / Lizabeth A. / 월드 사이언스 / 2006 / pp204-207