[생화학 실험보고서] RT-PCR analysis

소개

isolation한 RNA를 정량하고 RT-PCR analysis를 통해 cDNA를 합성하는 실험입니다.

목차

1. 목적
2. 원리
3. 시약 및 기자재
4. 실험방법
5. 실험결과
6. 고찰
7. 참고문헌
8. 추가문제

본문내용

4. 실험방법
※ 전 실험과정중에서 RNase contamination을 주의한다.
1) Spectrophotometer를 이용하여 RNA를 quantitation한다.
2) RNA 2 ㎍을 새 tube로 옮긴다.
3) Oligo-dT 1 ㎕를 넣는다.
4) DEPC-DW를 total volume이 10 ㎕가 되도록 채운다.
5) 70 ℃에서 10분간 incubation하고 ice에 박는다.
6) Spin down 시킨다.
7) RT 5X buffer 4 ㎕, dNTP 4 ㎕, RNasin 1 ㎕, Reverse transcriptase 1 ㎕을 첨가한다.
8) 42 ℃에서 1시간 동안 incubation한다.
9) 42 ℃에서 50분간 incubation한다.
10) PCR 준비를 한다(만들어진 cDNA를 -20 ℃에 보관할 수 도 있다.).
※ RNA 정량
RNA pellet을 0.1 % DEPC water로 녹이고 resuspension한다.
Sample 2 ㎕를 취해 0.1 % DEPC water 1 ml를 가해(500배 희석) UV로 정량한다(OD260=1은 40㎍/ml).

참고자료

· 1) 생화학실험(2) 실험교본, 교육과학기술부의생명특성화사업단.
· 2) 생화학실험(1) 실험교본, 교육과학기술부의생명특성화사업단.
· 3) Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer. 2007, Biochemistry, sixth ed.
· 4) http://en.wikipedia.org/wiki/