GFP정제

소개

이 실험은 널리 유용하게 사용되고 있는 GFP (Green Flourescent Protein) 를 직접 발현 시키고 이를 정제하여 여러 가지 방법을 통해 정량하는 것이 목적이었다.
GFP를 발현시키고 affinity chromatography로 쉽게 정제해내기 위해 대장균에 단순한 GFP가 아닌 N-ter His tagged GFP::pET vector construct를 transformation시켰고 이 때 사용한 대장균의 DNA strain은 E.coli BL21DE3이다.
우리가 사용한 GFP는 S65A+V68L+S72A+F99S+M153T+B163A라는 mutate시킨 것을 사용하였다.

목차

abstract
introduction
method
result
discussion
references

본문내용

이 실험은 널리 유용하게 사용되고 있는 GFP (Green Flourescent Protein) 를 직접 발현 시키고 이를 정제하여 여러 가지 방법을 통해 정량하는 것이 목적이었다.
GFP를 발현시키고 affinity chromatography로 쉽게 정제해내기 위해 대장균에 단순한 GFP가 아닌 N-ter His tagged GFP::pET vector construct를 transformation시켰고 이 때 사용한 대장균의 DNA strain은 E.coli BL21DE3이다.
우리가 사용한 GFP는 S65A+V68L+S72A+F99S+M153T+B163A라는 mutate시킨 것을 사용하였다.
첫 주에는 이렇게 GFP가 대장균 내에서 충분히 발현되도록 대장균을 접종하고 배양시킨다. 또한 이 때 발현된 대장균을 선별할 수 있도록 kanamycin을 resistant로 쓴다. 선별한 cell들을 다시 배양하고 단백질 과발현을 위해 IPTG를 첨가해 induction과정을 거치고 충분히 모인 cell을 sonication buffer에 넣고 centrifuge를 통해 cell down을 하고 pellet만 남긴다. 2주차 실험에선 모은 cell들을 깨고 단백질을 정제하는 과정을 거치는데, 이 때 cell을 깨는 방법은 초음파(20~50 kHz)를 이용한 sonication을 사용한다. sonication 하기 전에 우리가 얻고자하는 단백질이 protease때문에 분해 될 수 있으므로 이를 방지하기 위해 serine protease 저해제인 PMSF를 넣어준다. sonication 후 얻은 protein 중 우리가 원하는 protein 만을 얻어내기 위해 column에 His tag와 결합할 Ni-NTA resin과 protein을 binding 시켜 나머지는 제거하고, 이렇게 얻은 protein을 imidazole을 첨가해줘서 resin에서 분리한다. 이를 amicon ultra로 얻은 protein을 농축시킨다. 3주차 실험에서는 얻은 GFP를 여러 방법으로 분석하였는데, 하나는 SDS-PAGE를 이용하여 이미 GFP가 26.9 kDa라는 것을 이용하여 얻은 protein의 이동속도가 GFP와 같다는 것을 통해 존재를 확인하였고, 다음은 Lowry assay를 통해 얻은 protein의 standard curve와 농도를 계산하였고, 농도는 0.15 mg/ml였다. 그리고 fluorometer를 통해 우리가 얻은 GFP의 excitation되는 파장과 emission하는 파장을 표와 그래프를 통해 알아보았다.

참고자료

· 한국인간프로테옴기구 출판위원회, 프로테오믹스 연구기법, E*PUBLIC, pp 50~52
· p 63 pp 145~149 p 189
· David P. Clark, 알기 쉽고 재미있는 분자생물학, 라이프사이언스, pp 234~235
· Geoffrey M. Cooper, The cell 세포학, 한우리, 2000, p 118
· M. H. Gordon $ R. Macrae, 생물과학을 위한 기기분석, 교보문고, pp 175~182
· pp 189~193
· 각종 figure와 참고 - http://en.wikipedia.org/