Genomic DNA 추출 및 PCR 레포트.

소개

Genomic DNA 추출 및 PCR 레포트.

목차

1. 서론
2. .재료 및 방법
2.5mM dNTP, 10X buffer, Taq, D.W., tip, ice, desicator
① 가그린 20ml을 입에 넣은 후 1분간 입을 헹군다.
② 입에 있는 용액을 100ml tube에 넣고 labelling을 한다.
③ 원심분리시 균형을 맞추기 위해 무게를 잰 후, 동량의 다른 실험자와 함께 2500rpm 에서 10분 동안 원심분리한다.
④ 원심 분리 후, 상등액을 제거한다. 이때 pellet이 함께 쏟아지지 않도록 주의한다.
⑤ pellet이 있는 튜브에 25ml TE buffer를 넣은 후 vortexing하여 pellet을 녹인다.
⑥ 같은 양의 샘플을 가지고 있는 실험자와 함께 2500rpm에서 10분 동안 원심분리한 다.
⑦ 원심 분리 후, 상등액을 제거한다. 마찬가지로 pellet이 쏟아지지 않도록 주의한다.
⑧ 700μl의 lysis buffer를 첨가하여 pellet을 녹인다.
⑨ 700μl의 lysis buffer가 들어있는 샘플을 1.5ml 튜브로 옮긴 뒤 labelling 한다.
① 4℃ 원심분리기에서 13000 rpm으로 10분 동안 원심분리한다.
② 600㎕의 70% 에턴올을 첨가한 후 5분 동안 세척한다.
③ desicator에 sample을 넣어 건조시킨 후, 100㎕의 TE buffer를 첨가한다.
④ PCR에 사용될 혼합용액을 만든다.
⑤ 혼합 용액에 템플릿을 넣은 후 37℃ annealing temperature에서 30cycle로 PCR을 돌린다.
3. 결과
4. 논의
5. 참고문헌

본문내용

이번 실험은 VNTR ( Variable Number of Tandem Repeats)을 이용하여, 나의 genomic DNA를 추출하여 보고, PCR기법을 통해 증폭시켜 보는 실험을 하였다.
VNTR은 진핵세포의 gene에서 여러 부위에서 관찰되는 짧은 반복 서열을 말한다. VNTR은 RFLP의 가장 흔한 형태이다. RFLP는 유전자를 제한효소로 절단하였을 때, 절단된 유전자가 개인에 따라 다양하게 나타나는 현상을 일컫는다. 이러한 RFLP현상은 염기서열이 반복되기 때문에 나타나는 현상이고, 이렇게 반복되는 염기서열을 VNTR이라고 하는 것이다. VNTR은 반복 횟수가 대단히 많고, 또 반복횟수가 일치하는 사람을 찾기 힘들기 때문에 유전자 마커로서 사용된다고 한다. VNTR은 반복서열의 염기쌍 수에 따라, Minisatellite와 microsatellite로 나뉘는데 minisatellite은 5개 이상의 염기 쌍으로 이루어진 반복서열을 말하며 microsatellite 5개 이하의 반복서열을 말한다. 이를 통해 이번 실험에서 왜 VNTR 유전자가 사용되는지를 알았고, 2종류의 VNTR유전자 중 minisatellite가 마커로 이용되었다.
DNA 추출 후 전기영동 결과, 10kb 위의 밴드가 가장 밝았고, 1.5kb-1.0kb 사이, 1.0kb-0.8kb 사이에서 밴드가 발견되었다. 10kb 위의 밴드가 genomic DNA인 것으로 생각되며 크기가 큰 이유는 반복되는 염기쌍 수가 많아서 그런 것으로 생각된다.
1kb ladder의 6번 째 band인 3kb band의 DNA양을 1㎕당 1.0㎍이라 하면, 실험시 사용한 ladder의 양은 3㎕이므로, 3.0㎍이 된다. 나의 DNA양과 비교시 약 100배 가량 많은 것으로 1/30으로 희석해야 하는 것으로 생각된다.
밴드의 가장 아래는 뿌옇게 보이는 두꺼운 밴드가 관찰되었는데 이것은 DNA가 아니고 실험과정 중 RNA 또는 다른 단백질이 완전히 제거되지 않아서 생긴거라 생각된다.
PCR을 위해 D1S80 프라이머가 이용되었는데, VNTR유전자 중 D1S80 좌위를 사용하였기 때문이며 D1S80 좌위는 반복서열이 16개로 구성되어 있는 minisatellite 마커이므로 PCR분석에 적합할 것으로 생각된다.

참고자료

· - 정연보, 2008, DNA의 진실, 김영사. p96~104
· - http://www.wikipedia.org