정제,재접기,유전자 재조합 녹농균 형광 리파아제의 특성 표시

소개

Purification, refolding, and characterization of recombinant Pseudomonas fluorescens lipase
SCI 논문을 요약한 정리하여 파워포인트로 만든것입니다.

목차

1. 개 요
2. 봉입체의 준비와 재접기
3. 얼룩과 효소의 분석 활동
4. 분광기 관찰
5. 결 과
6. 그림과 표

본문내용

개 요
1. 우유 손상의 원인이 되는 녹농균의 형광 sik w1리파아제(pfl)의 내성은 대장균의 몸에서 봉입체만큼 과잉발현.
2. 용해도를 높이는 PFL의 재생은 크로마토그래피를 재접기하는 크기-배제 단백질을 이용해서 얻는다.
3. 재생효소는 겔여과와 이온 교환 FPLC를 이용해서 균질의 정제.
4. 특정한 활동은 Ca2+의 증가로 찾을 수 있음.
5. Ca2+의 존재-> pfl 구조는 구아니딘 염산의 재생과 dmso와 trifluoroethanol구조의 효소를 유지하는데 중요한 역할
봉입체의 준비와 재접기
1. PFL을 갖고 있는 세포 배양
2. 원심분리기(15min at 8000g)에서 배양세포를 재현탁
3. 봉입체-원심분리기(30min 12,000g)에 의해 분리
4. 2% trion x-100을 포함하는 소산완충기- 세포파편과 다른 불순물 제거
5. 10ml의 변성 완충기에서 재현탁
6. 원심분리기(30ml 12.000g)- 불용성 구성요소 제거
7. 표면에 떠 있는 불순물- 0.45μm의 주사기 여과기로 여과
봉입체의 준비와 재접기
1. Sepros는 생물학 lp시스템에 재접기한 완충기(20 mm tris-hcl, ph 8.0, and 10 mm cacl2)와 sephacryl s-200을 사용해서 4 °C 에서 수행
2. 용해도를 높인 봉입체는 8 m 요소 (1.5 ml)에 그 컬럼 (2.5 * 75 cm)을 적용
3. 완충기를 재접기해서 평형시키고 1.5 ml/min에 용출
4. Sepros- 활동적인 부분의 공유와 농축
5. Superdex 200 HR prepacked column 을 사용하는 겔여과법 FPLC에 적용
봉입체의 준비와 재접기
6. 활동적인 부분은 mono q prepacked 컬럼을 사용하는 이온 교환 FPLC에 의해 더 잘 분리되었고 그리고 리파아제 활동이 있는 부분은 공유되고 농축한 superdex 200을 사용하고 있는 두번째 겔 여과법 FPLC를 사용했다.
7. Pfl은 sepros를 사용하면서 재접기되었고 ca2+가 없는 경우 더 깨끗이 정화->제한인자로 사용
얼룩과 효소의 분석 활동
1. SDS-PAGE: 활동적인 부분을 파랗게 물들여서 식별
-> refolding 완충기에서 배양
2. 배양한 겔-> β-naphthyl 초산염과 빠른 파란 RR을 포함하는 100 mm tris-hcl과 ph 8.0의 용액으로 옮기고
30분의 뒤흔들기 후, 물로 씻고 7% 아세트산에 저장.

참고자료

· 없음