SDS-PAGE & western Blotting Antibody production

목차

■ SDS-PAGE
SDS-PAGE에서 단백질이 분리되는 원리
■ Western Blotting
Western blot의 원리

본문내용

■ SDS-PAGE
SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis는 생화학과 유전학 및 분자 생물학에 이용되는 단백질 분리 기술로, 그들의 전기 영동 이동성(polypeptide chain의 길이 또는 분자량 뿐만 아니라 Protein folding, Posttranslational modification과 다른 인자들에 의한)을 이용한 기술이다


SDS-PAGE에서 단백질이 분리되는 원리

처음 단백질의 solution은 SDS를 첨가한 후에 분석된다. 이 음이온화 detergent는 2차 구조와 non-disulfide bond에 의한 4차 구조를 denature 시킨다. 또한 단백질의 질량에 따라 일정 비율로 각 단백질을 – charge를 띠게 한다.
SDS가 없이는 분자량이 비슷한 다른 단백질들이 protein folding의 차이로 인해서 다르게 이동하는데, folding 방식의 차이에 따라 어떤 단백질들은 겔에서 다른 단백질보다 크기가 더 잘 맞아서 빠르게 이동할 수도 있다.
SDS를 첨가함으로 이러한 문제점들을 해결하고 선형으로 단백질을 만들어 분자량(일차구조 또는 아미노산 수)의 크기에 따라 분리할 수 있게 된다. SDS가 단백질에 붙는 비율은 대략 1.4g SDS에 1.0g 단백질이다. 물론 그 범위는 1.1-2.2g SDS/g protein의 비율로 나타날 수 있다. 이 비율은 대략 전체 질량에 비례한다. 대부분 단백질은 이에 따라 오직 단백질의 사이즈만 겔 내 이동거리와 관련되어 겔 속을 움직이게 된다. Tracking dye가 단백질 solution에 첨가되어 실험에서 전기영동 시에 단백질의 이동을 구분할 수 있게 된다.
Denature 된 단백질은 PAG의 Buffer에 잠겨 있는 PAG의 한쪽 끝에 놓는다. 전류가 겔을 통해 흐르면 –charge의 단백질은 anode로 이동하게 된다. Size에 따라서 각 단백질은 다르게 겔을 통과한다. 작은 단백질은 쉽게 겔의 pore를 통과하고 더 멀리가게 된다.. 따라서 정해진 얼마의 시간(전압의 크기에 따라 해상도가 다르며, 수 시간이 소요될 수 있다)이 지나면 size 별로 이동성이 다르게 분리가 되어 있다.
큰 단백질은 시작점에 가까운데 반해 작은 단백질은 더 많이 이동하게 된다. 이후에 Coomassie Brilliant Blue나 silver stain으로 염색한다. 염색이 끝나면 각각의 단백질들은 다른 밴드를 나타내게 된다. Marker 단백질을 사용하여 각 단백질들의 크기를 측정할 수 있다

참고자료

· http://blog.naver.com/kaykong?Redirect=Log&logNo=130025402893
· http://nanumlog.tistory.com/129