Protein preparation from plant tissues

소개

단백질 분리에 사용 할 sample buffer를 조성하는 실험이었습니다.

1. acetone의 역할
2. UREA sample buffer의 조성과 역할

위의 2가지에 대한 discussion이 있답니다.
많지는 않지만 실험 중간에 찍은 사진도 함께 넣었습니다.

목차

없음

본문내용

Material
실험복, 실험용 장갑, 튜브, 튜브꽂이, 피펫, 얼음, RNA extraction buffer, homogenizer, PCI, acetone, centrifuge, pellet vaccum dry, heat block
Method
*virus : CMV, TMV
1. dry sample을 1.5ml tube에 넣는다.
2. 얼음에 박은 후 RNA extraction buffer 400μl을 넣는다.
3. homogenizer로 곱게 갈아준다.
4. PCI 400μl 넣어준 후 inverting한다.
5. centrifuge, 12000rpm, RT, 5min
6. 상층과 하층을 모두 따서 버린다.
7. acetone 1ml을 넣어준 후 vortex해준다.
8. centifuge, 12000rpm, 4℃, 5min
9. 상층액 제거 후 acetone 1ml을 넣어준 후 inverting해준다.
10. centifuge, 12000rpm, 4℃, 5min
11. pellet vaccum dry 약 7분 (NO-heat)
12. 1X sample buffer 200μl을 넣는다.
13. heat block에 20min 간 끊인다. (80℃)
14. -20℃ or -70℃에서 보관한다.
Result
Discussion
1. acetone의 역할
물과 잘 혼합하는 유기용매인 acetone을 단백질 용액에 가하면 유기용매가 지질을 제거하고, 단백질에 수화된 물을 제거하므로, 용액의 비유전율을 변화시켜 단백질이 응집되어 침전시키는 것이다.
유기용매에 의한 침전법
효소는 일반적으로 물과 균일하게 혼합되며, 또한 효소수용액의 투전항수(透電恒數)를 저하시키는 유기용매인 acetone, ethanol, methanol, propyl alcohol, butyl alcohol, dioxane 등에 의하여 침전된다.
이 침전성은 효소의 성질에 따라 여러 가지로 다르게 나타나므로 이들 용매를 적당하게 이용하여야 효소 정제의 목적을 달성할 수가 있다.
처음 결정으로서 분리된 효소 urease는 단순히 acetone처리에 의하여 얻어진 것이다. 이들 유기 용매의 침전 능력은 온도에 크게 영향을 받는다. 보통 저온일수록 잘 침전시킬 수가 있다.
또한 이들 용매는 효소를 침전시킴과 동시에 효소단백질을 변성시키는 성질도 있으므로 주의하지 않으면 안되며, 변성도는 온도가 낮을수록 적다.
이와 같은 여건으로 볼 때 본 조작도 저온에서 행할 필요가 있다. 그리고 유기 용매에 의하여 침전시킬 때에는 효소용액 중 어느 정도의 염류가 함유되어 있는 편이 침전성이 좋으며, 또한 변성도도 적게 나타나므로 효소액에 일정 농도의 염 또는 완충액을 첨가하고 저온에서 용매를 가한다.

참고자료

· http://www.nics.go.kr/R_Study/mpaqec/component/protein/pqualitative/precipotatep.htm
· http://www.nics.go.kr/R_Study/mpaqec/enzyme/enzyme01/enzyme08.htm
· http://www.ksmb.or.kr/home/kor/board/downloadfile.asp?fileid=1203&filename=blood%2C+bone+marrow+Sample+collection+method.pdf
· http://bric.postech.ac.kr/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=752
· http://mybox.happycampus.com/ydmind/1952617