SDS-PAGE

소개

SDS-PAGE

목차

Ⅰ. Abstract
Ⅱ. Introduction
Ⅲ. Materials
Ⅳ. Chemical reagent & Apparatus
V. Methods
Ⅵ. Results
Ⅶ. Discussion
Ⅷ. Reference

본문내용

Ⅰ. Abstract
저번 실험에서 추출한 당근의 단백질을 가지고 크기별로 분리하는 실험이다. 여러 종류의 단백질이 추출한 단백질 안에 들어있지만 SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리해 내는 것이다. 이것은 western-blot과 연계되어서 우리가 원하는 단백질의 크기를 확인할 수 있고 전기영동의 어느 부분에 위치하였는지도 알 수 있다. SDS-PAGE로 크기별로 분리해 내는데 SDS란 DNA의 전하를 모두 음전하로 바꿔주는 것을 말하고 sample buffer에 있는 DTT로 인해 이황화결합을 끊어주어 질량에 의해 이동속도의 차로 분리하는 원리를 이용한다. 이것을 polyacrylamide gel에 전기영동 시키면 단백질의 크기에 따라 band가 형성되는데 이 때 표준곡선을 작성하면 미리 알고 있는 크기가 아닌 미지의 단백질까지도 크기(MV, Molecular weight)를 추정할 수 있다. gel을 이동시킬 때에는 두 가지 성질의 gel을 이용하는데 stacking gel과 resolving gel을 이용한다. 이 두 gel은 pH의 차이에 따라 그 속에 함유된 Glycine의 전하가 바뀜으로써 이동 속도가 변하는 것을 이용한다. stacking에서는 단백질의 속도가 Cl-과 glycined의 중간이라서 잡혀있게 되지만 resolving에서는 pH가 바뀌고 glycine의 속도가 변하면서 단백질의 속도가 Cl-과 glycine보다 차이가 나므로 달릴 수 있게 되는 것이다. 단백질을 SDS-PAGE한 결과 여러 개의 band를 확인할 수 있었고 우리가 많이 다뤘던 HsP17.7의 대략적인 위치를 알 수 있었다. 임의로 지정된 크기를 정확히 알 수 없던 단백질의 크기도 표준곡선의 추세식을 이용해 계산하였다. 계산하여보니 그 위치에 있는 단백질은 대략 49.7kDa이다. 이렇게 분리된 단백질을 membrane에 transfer하고 실험을 마무리하였다.
Ⅱ. Introduction
1) SDS-PAGE 원리
단백질은 각각 자신의 독특한 질량과 pI 값이 있다.
SDS-PAGE는 이 두 요소 중에서 질량의 차이를 이용한 분리방법이다. 먼저 SDS라는 detergent를 이용하여 모든 단백질이 동일한 (-) 전하를 띄도록 만든 후 질량에 의한 polyacrylamide gel 상에서의 이동속도 차를 이용하여 분리하게 된다. 이때 sample buffer에 DTT나 mercaptoethanol이 첨가되어 있어 disulfide bond도 끊어지게 되어 단백질은 일차구조를 형성하여 이동하게 된다.
2) SDS의 작용
SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)는 amphipathic의 특성을 가지는 대표적인 detergent로서 단백질과 가장 강력한 결합력을 보인다. 일반적으로 단백질을 구성하는 아미노산 2개에 SDS가 1개 정도가 결합하게 되어 단백질들은 고유의 전하를 다 잃어버리고 SDS에 의해 (-) 전하를 띄게 된다. SDS의 작용으로 denatured된 단백질은 막대기처럼

참고자료

· 1) http://www.genehunters.co.kr/Training/03_1.htm
· 2) http://www.elpisbio.com/sub/support/protocols/Protocols.htm
· 3) 분자생물학 2판 / Robert F. Weaver / 라이프사이언스 / 2003. 2