Experimental Practice of Biochemistry (Detection of the Gene-specific Products)

소개

Experimental Practice of Biochemistry (Detection of the Gene-specific Products)

목차

RNA extraction from tissue
1st stranded cDNA preparation by Oligo dT
Detection of Gene Products by Polymerase Chain Reaction (PCR)

본문내용

이번 실험의 목적은 특정 조직에 존재하는 유전자의 산물(mRNA)를 검출하는 것이다. 이번 실험에서 조직은 rat의 liver나 lung을 이용하고, 유전자는 β-actin을 이용한다.
실험에서 필요한 mRNA는 구조적으로 불안정하여 RNase에 취약하여 분해가 쉽게 일어나기 때문에 비말 및 타액이 들어가지 않게 주의해야 한다.
실험은 크게 세 단계로 이루어져있다.
1. RNA extraction from tissue
2. 1st stranded cDNA preparation by Oligo dT
3. Detection of Gene Products by Polymerase Chain Reaction (PCR)

RNA extraction from tissue
[ procedure ]
Tissue (~10mg) in 0.2 ml of easy-BLUE(TRIZOL) reagents
- Easy-Blue는 RNA를 추출하기 위한 페놀 성분이 있는 파란색 시약이다.

Add 40µl of chloroform, vortex vigorously for 1min.
- 이 과정에서 세포가 깨지면서 세포 안에 있던 물질들이 밖으로 나오게 되고, 수층과 유기용매층으로 분리된다. 수층에는 RNA가 녹게 된다.
- Chloroform은 유기용매로써, 비중이 크고, 독성이 크며, 기화가 잘 되는 성질이 있기 때문에 바닥에 떨어지면 바로 기화되어 마취효과를 낸다. 따라서 피펫의 음압보다 중력에 의해 잡아당기는 힘이 더 커서 피펫 밖으로 흘러내리므로 작업동선을 짧게 하는 것이 중요하다.

Put the tube at RT for 5-10 min.
- 층이 분리되도록 기다리는 과정이다.

Centrifuge at 12000X g for 10 min at 4℃, sup.

Once of PCI extraction (same vol of PCI solution, vigorously vortex for 1 min.), centrifuge.

참고자료

· 없음