GFP 정제 및 분석

소개

이번 실험에서는 강한 형광을 발하여 관찰이 용이한 GFP를 mutations시켜서 N-ter His tagged GFP를 사용하였다. IPTG induction을 하여 Protein를 발현시키고 Sonication으로 cell을 fractionation하고 centrifugation으로 분획하여 원하는 Protein인 GFP를 Immobilized-metal affinity chromatography(IMAC)을 이용하여 정제하였다. 이렇게 발현되고 정제된 Protein을 정량하기 위하여 sensitivity가 높은 Lowry assay를 이용하여 Protein의 농도를 구하였고 이를 통해 적정량의 Protein을 SDS-PAGE를 하였다. Induction test한 sample을 SDS-PAGE gel에 running 하여 induction condition을 확인하였고, spectrofluorometer 측정으로 fluorophore가 있는 GFP의 excitation과 emission을 확인하였다.

목차

Abstract:
Introduction:
Materials & Methods:
Result:
Discussion:
Reference:

본문내용

Abstract:
이번 실험에서는 강한 형광을 발하여 관찰이 용이한 GFP를 mutations시켜서 N-ter His tagged GFP를 사용하였다. IPTG induction을 하여 Protein를 발현시키고 Sonication으로 cell을 fractionation하고 centrifugation으로 분획하여 원하는 Protein인 GFP를 Immobilized-metal affinity chromatography(IMAC)을 이용하여 정제하였다. 이렇게 발현되고 정제된 Protein을 정량하기 위하여 sensitivity가 높은 Lowry assay를 이용하여 Protein의 농도를 구하였고 이를 통해 적정량의 Protein을 SDS-PAGE를 하였다. Induction test한 sample을 SDS-PAGE gel에 running 하여 induction condition을 확인하였고, spectrofluorometer 측정으로 fluorophore가 있는 GFP의 excitation과 emission을 확인하였다.
Introduction:
이번 실험에서는 세포배양을 통하여 단백질을 추출한다. 이는 유전자 재조합 기술에 의해 원하는 유전자를 박테리아에 삽입시켜 형질전환을 시키고 이것을 배양하여 원하는 단백질만을 분리 정제하여 얻는 방법이다.
실험에서 발현시키고 정제할 단백질은 GFP(Green Fluorescent Protein)이다. 원래는 Aequorea victoria라는 발광 해파리에 존재하는 단백질이며, 이 단백질은 자외선을 받으면 녹색의 형광을 띄는 성질이 있다. GFP는 자외선(UV)를 흡수하여 저에너지광이라고 할 수 있는 green light로 자신의 빛을 방출시킨다. 만일 cell에 이 GFP를 coding하고 있는 DNA나 mRNA를 집어넣으면, 이내 GFP가 세포 내에서 합성되어 강한 형광을 발하는 것을 볼 수 있다. 특히 관찰이 용이하다는 장점으로 인해 유전자 발현의 유무를 측정하는데 매우 유용하게 쓰인다. 즉, 발현 정도를 조사하고 싶은 유전자 앞에 GFP Coding Sequence를 달면 실제 조사하길 원하는 유전자가 발현할 때 같이 GFP가 형광을 발현하게 되므로, 유전자의 발현을 조사하는데 매우 용이하다. GFP는 무수히 많은 실험에서 쓰이며 일반적으로는 큰 독성을 가지고 있지 않는 것으로 보고 있다.

참고자료

· - 강병철, 세포학, 2000, 한우리, p.23, pp.27~29, p.118
· - David L.Nelson, Lehninger Principle of Biochemistry 4th ED., 2005, W.H.Freeman and Company, pp.92~93, p.150
· - 한국 생화학회, 실험생화학,1997, 탐구당 pp.53-72, pp.171-206