천일염 토양의 메타게놈으로부터 비타민 B1 리보스위치 발굴 및 기능 분석 (Identification and functional analysis of vitamin B1 riboswitch from the metagenome of sun-dried saline soil)

서지정보

· 발행기관 : 한국국제농업개발학회
· 수록지 정보 : 한국국제농업개발학회지 / 29권 / 1호 / 70 ~ 77페이지
· 저자명 : 이창묵, 이영석, 김수연, 심준수, 윤상홍, 스부라마니안 파르티반, 김동헌, 한범수

초록

본 연구에서는 리보스위치 서열 확보와 기능검정을 위하여천일염 생산을 위한 최종 증발지에 있는 고염도의 토양을 채취 하여 메타게놈의 염기서열을 수집하였다. 비타민 B1의 리보스위치(TPP-box) 중심서열을 문헌 검색을 통하여 TPP-box motif를 가진 91개 중심서열을 확보하였으며 D8PYI의 리보스위치로서의 기능을 생물검증으로 확인하기 위하여 pGFPuv 벡터를 재조합한 바이오센서를 구성하였다. D8PYI유래 절편들은 각각 pLac 프로모터 아래 위치한 GFP 리포터 유전자의발현되는 총량을 측정하여 리보스위치 서열의 기능을 구명하였다. 이러한 연구는 국내·외 모두 기초 정보가 될 수 있는리보스위치의 조절 메커니즘이나 식물에서의 탐색이 매우 제한적으로 이루어져 있고, 환경에 존재하는 막대한 미탐색 미생물 메타게놈에 대한 리보스위치 탐색과 기능연구 등에 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
1. 천일염 토양으로부터 총 44,740개의 read 갯수를 확보하였으며, 16,730,645 bp의 총 염기서열 정보량을 확보하였으며 전체 read에 대해 1.6%인 708개가 assembly됨을 확인할수 있었다.
2. Blast 프로그램 수행 결과, 비타민 B1 리보스위치 TPPbox 부위와 유사한 것으로 D8PYI contig로 총 9번에 걸쳐서seed 들과 유사성을 보였다. Match 된 부위도 24 bp~30 bp이었으며, E-value도 3e-007에서 9e-004로 통계적인 유의성을 알수 있었다.
3. D8PYI contig 336~365 bp 부위는 염기서열 상 TPPbox의압타머 구조와 유사한 RNA 2차 구조를 형성하는 것을확인할 수 있었다.
4. D8PYI의 기능 검정용 바이오센서 구축을 위하여 PCR로증폭한 D8PYI의 부위는 각 106 bp, 204 bp, 300 bp와 396 bp를 이용하여 pGFPuv 벡터에를 구축하였다.
5. D8PYI가 삽입된 바이오센서에는 비교군에 비하여 TPP(3 mM)가 존재하는 배지에서 배양한 TOP10균에서 전반적으로낮은 형광세기를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

영어초록

Riboswitches are structured RNA motifs that can directly bind specific metabolites.
The binding of metabolites further regulates downstream metabolism eliminating the need for any regulatory proteins. We searched for novel bacterial vitamin B1 binding riboswitches in the metagenome of sun-dried saline soil. Soil microbial metagenomes were studied using NGS analysis. A total of approximately 50 Gb of the sequence data was obtained by Hi-seq and 454 GS FLX sequencing, and these sequences were subjected to riboswitch search. Hi-seq generated 614 contigs showing similarity to riboswitches, while 454-based sequencing generated 383 similar contigs. We matched whole metagenome contigs to local BLAST databases constructed using 91 previously known bacterial vitamin B1 thiamine pyrophosphate (TPP)-box motifs, and 11 SAM S-box motifs.
Repetitive BLAST comparisons to local BLAST databases with nucleotide sequences from NGS identified 14 novel TPP-box motifs, and 7 S-box motifs respectively from the metagenome contigs.
Further, RNA secondary structure analysis with public databases Rfam, and RibEx using these 21 riboswitch candidates revealed one contig, D8PYI to possess the most probable TPP-box structure.
We constructed intragenic synthetic riboswitches to investigate whether the TPP-box motif region in D8PYI could harness gene expression in the presence of TPP. Construction of biosensors containing 100~400 bp fragments of D8PYI contigs, and in vivo imaging using the biosensors displayed TPP-specific changes in the expression of a green fluorescence protein reporter. In this regard, the adaptation of in silico riboswitch screening from environmental metagenomes could provide biosensors for detection of specific metabolites.

참고자료

· 없음