코돈최적화를 통한 합성 조직형 플라스미노겐 활성화인자의 형질전환 담배 내 발현 (Expression of Synthetic Tissue-Type Plasminogen Activator Protein in Transgenic Tobacco Plants)

서지정보

· 발행기관 : 한국국제농업개발학회
· 수록지 정보 : 한국국제농업개발학회지 / 22권 / 4호 / 393 ~ 398페이지
· 저자명 : 심준수, 차소영, 한정순, 강솔, 헤마바티, 김용환, 한범수

초록

본 연구에서는 현재 전 세계적으로 혈전용해제로서 널리 사용되어지고 있는 t-PA를 담배에서 생산하기 위해 t-PA 유전자를 코돈최적화를 통해 합성하여 담배 rbcS 프로모터하에서 발현을 유도하였다. 합성된 t-PA 유전자는 발현 벡터를 이용하여담배 형질전환을 실시하였고, 동물세포 유래 t-PA와의 인공 혈전용해 활성 및 분자량의 동등성 등의 특성을 규명하였다.
1. 담배의 codon usage에 맞게 t-PA 유전자를 합성하였고,담배 형질전환체 잎에서 피브린 분해 활성이 있는 효소학적으로 안정된 재조합 t-PA의 발현을 확인하였다.
2. 합성 t-PA 유전자의 담배 genomic DNA내의 삽입과 전사는 PCR과 RT-PCR법으로 측정하였고, t-PA 유전자의 PCR 산물(1.6 kb)을 관찰하여 담배 염색체 내에 삽입되어 있음을확인하였다. 또한 t-PA의 전사체 크기에 해당하는 1.6 kb의PCR 산물을 관찰하여 담배 잎 내에서 정상적인 전사가 이뤄지고 있음을 확인하였다.
3. 담배 형질전환체 잎의 전체 수용성 단백질 중 합성 t-PA 의 평균 발현양은 0.03 μg/TSP mg으로 측정되었고, 가장 높은 발현양은 0.0903 μg/TSP mg로 관찰하였다.
4. 담배 잎 추출물 내에 존재하는 합성 t-PA 단백질의 피브린 분해 활성은 상업적으로 판매되는 재조합의 t-PA 단백질과동등한 활성을 나타냈고, 담배 형질전환체들의 피브린 용해 활성의 평균값은 0.2589 cm2 lysis zone을 나타냈고, 피브린 용해 활성의 최대치는 0.9 cm2 lysis zone이었다.
5. 형질전환 담배 잎에서 발현된 재조합 합성 t-PA의 분자량을 분석한 결과 동물세포 유래 t-PA와 유사한 크기의 65kDa으로 확인하였다.
6. T-PA 단백질을 발현하는 담배 형질전환체들은 식물체의키, 색깔, 모양, 잎의 개수, 성장속도, 종자의 생산량 등과 같은 표현형에 있어 야생종 담배와 별 다른 차이를 보이지 않았으며 후대에도 안정적인 t-PA 활성을 나타내었다.

영어초록

Human tissue-type plasminogen activator (t-PA) which is found in blood and tissues is one of the proteolytic enzyme. T-PA causes fibrin-specific plasminogen activation that can dissolve blood clots in the vasculature. In order to produce recombinant t-PA (st-PA) proteins in transgenic tobacco plants, the t-PA gene was codon-optimized and cloned into a plant binary vector (p221a-rbcS-st-PA) harboring a tobacco rbcS promoter, a tobacco etch virus leader sequence, an N-terminal signal peptide of the alfala glucose-regulated endoplasmic recticular protein and a 35S terminator. The plasmid was transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 and then the Agrobacterium-mediated transformation of tobacco leaf discs was performed. The insertion of the st-PA gene in genomic DNA of transgenic tobacco plants and the presence of its transcript were verified by PCR and RT-PCR, respectively.
We investigated the fibrinolytic activity of recombinant st-PA proteins and quantified their amount to determine the expression level of st-PA proteins in transgenic tobacco leaves. Enzyme-linked immunosorbent assay determined that the highest level of recombinant st-PA expression was 0.09 μg/total soluble protein (mg) in transgenic tobacco plants. The amount of recombinant st-PA proteins in transgenic plants was estimated to range from 0.001 to 0.009% of total soluble proteins. Immuno-blot analysis of transgenic tobacco leaves revealed a single band of approximately 68 kDa recombinant st-PA proteins.
These results demonstrated the expression and in vitro activity of recombinant st-PA in transgenic tobacco plants. Thus it provides the information for the additional production of recombinant pharmaceutical proteins using plant system.

참고자료

· 없음