[A+] 2024 서강대 현대생물학실험2 2차 (TA cloning, transformation)

소개

"[A+] 2024 서강대 현대생물학실험2 2차 (TA cloning, transformation)"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Materials & Methods
4. Results
5. Discussion
6. References

본문내용

이번 실험에서는 증폭한 PCR product를 agarose gel 전기영동을 통해 분리하고 gel purification을 통해 순수한 DNA를 얻었다. 얻은 DNA sample은 PCR에 사용한 Taq polymerase에 의해 3’말단에 A overhang을 가지고 있으므로 이를 이용하여 pGEM-T vector에 cloning하였다. pGEM-T vector는 ampicillin 저항성 유전자를 포함하고 있고 lacZ 유전자 사이에 insert DNA가 삽입된다. 따라서 transformation 후, IPTG와 X-Gal이 포함된 ampicillin-LB agar plate에 대장균을 배양하였을 때 colony의 색깔을 통해 plasmid DNA의 재조합 여부를 확인할 수 있었다. Plasmid DNA가 재조합되어 β-galactosidase가 발현되지 않고 X-Gal이 분해되지 않은 흰색의 colony를 picking하여 배양하고 mini-scale preparation을 통해 대장균 세포로부터 plasmid DNA를 추출하였다. Mini-prep에서는 염기성에서의 circular DNA와 linear DNA의 denaturation 정도가 다른 것을 이용하며 추출한 plasmid DNA는 전기영동을 통해 확인하였다. Mini-prep 후 전기영동 결과 band가 관찰되지 않았다. Transformation 후 plate에서는 white colony가 관찰되었기 때문에 mini-prep 과정에서 문제가 있었을 것으로 예상된다. Lysis와 neutralization buffer를 넣은 뒤 inverting을 너무 세게 했거나 반응 시간을 맞추지 못해 DNA가 손상된 것으로 예상된다.

참고자료

· Lizabeth A. Allison (2021), Fundamental Molecular Biology, 3rd, World Science, pp. 513~514
· Geoffrey M. Cooper (2019), The Cell A Molecular Approach, 8th, Oxford University Press, pp. 124~126
· David L. Nelson (2021), Lehninger Principles of Biochemistry, 8th, W.H. Freeman and Company, pp. 305~306