[충남대] 분자생물생화학실험 - 대장균 IPTG 처리, 크로마토그래피, 재조합 단백질 생산

소개

충남대 분자생물생화학실험 보고서 입니다! (A+)

목차

I. 서론

II. 재료 및 방법
1. Recombinant protein production
2. Total protein extraction
3. Affinity chromatography (Ni-NTA)
4. Size exclusion chromatography (FPLC)
5. SDS-PAGE
6. Bradford assay
7. Enzyme activity assay

III. 결과

IV. 논의

V. 참고문헌

본문내용

Escherichia coli BL21 그리고 BL21(DE3)은 재조합 단백질 생산을 위한 일반적인 실험실 균주이다. BL21에서 파생된 E.coli BL21(DE3)은 재조합 단백질의 고수준 발현에 가장 널리 사용되며 T7 RNA polymerase 유전자를 제어하는 박테리오파지λ에서 유래된 prophage DE3를 갖고 있다[1]. 대장균에서 도입 유전자 발현을 위해 쓰이는 프로모터는 주로 조절성이다. lac 프로모터는 대장균의 젖당 오페론에서 쓰이는 프로모터로서 lac repressor가 있을 때 발현이 없다가 젖당 또는 젖당의 유사체(IPTG 등)가 있을 때 억제자가 프로모터에 결합하지 못하므로 유전자 발현이 일어난다. 이 lac 프로모터를 발현하고자 하는 표적유전자와 함께 삽입하면 이 유전자는 젖당 의존적 발현을 하게 된다. T7 발현 시스템은 lac 프로모터와 T7 프로모터를 복합적으로 사용하는 것으로 다른 프로모터와 달리 촉진성 발현 조절 양식을 채택하고 있다. T7 발현 시스템으로 단백질을 발현하려면 T7 프로모터를 지닌 발현 벡터와 DE3 유전자가 삽입된 대장균 균주를 사용해야 한다. DE3란 lac 프로모터에 의해 조절되는 T7 RNA 중합효소 유전자이다. T7 프로모터가 든 발현 벡터에 표적유전자를 재조합하여 적절한 대장균 균주에 도입하여 선별한다. 이후 이 대장균을 IPTG로 처리하면 T7 중합효소의 발현이 일어난다. 이후 이 중합효소는 T7 프로모터에 결합하여 표적유전자 발현을 시작한다[2]. 실험에 사용한 vector는 pET28a이다. 유도되지 않은 발현을 억제하기 위해 T7 promoter 및 인접한 lac operator 서열을 포함한다. 발현될 coding 서열은 poly-histidine purification 및 thrombin protease recognition site에 대한 코딩 서열의 frame과 함께 클로닝되어 생산된 재조합 단백질을 만들 수 있다[3].

참고자료

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· Cengiz Kaya et al. 2020. Involvement of l-Cysteine Desulfhydrase and Hydrogen Sulfide in Glutathione-Induced Tolerance to Salinity by Accelerating Ascorbate-Glutathione Cycle and Glyoxalase System in Capsicum, Antiodants, 9(70) 603.
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· Xu, Dong, Nussinov, Ruth. 1998. Favorable domain size in proteins, Folding & Design, 3(1): 11–17.
· 강병욱. 2017. 대두(Glycine max)의 L-cysteine desulfhydrase 기능에 중요한 O-acetyl-serine(thiol) lyase 아미노산 잔기 규명, 충남대학교 대학원 석사학위논문, pp.35~36