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7주차_단백질정제

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최초등록일 2023.11.15 최종저작일 2023.11
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7주차_단백질정제
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    소개

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    목차

    1. Result
    2. Discussion
    3. Further Study
    4. References

    본문내용

    ① Ni-NTA agarose 수지를 이용한 단백질 정제
    ② 6x-His tagged protein을 Ni-NTA agarose 수지를 이용, chromatography를 통해 정제할 수 있다.
    ③ Result
    ▲ Washing buffer 추가 후 ▲ elution fraction
    ◀ SDS PAGE 결과
    -우리 조의 실험 결과에서 가장 두꺼운 band의 size는 약 70kDa로 이 단백질이 실험에서 정제하고자 한 단백질이다. 예측했던 size는 75kDa인데 이보다 조금 작은 단백질 size가 관찰되었다.
    ④ Discussion
    -1조의 경우 다른 조들에 비해 모든 band의 굵기가 얇고 흐리게 나온 것으로 보아 단백질의 loading이 적게 되었을 것이라 생각하였다.

    참고자료

    · Michael M.Cox, Jennifer A.Doudna, Michael O’Donnell - Molecular Biology_ Principles and Practice-W.H.Freeman & Company (2015), Ch.7
    · Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Gregory J. Gatto Jr., Lubert Stryer - Biochemistry-W. H. Freeman (2015), Ch.5
    · https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/cloning/competent-cells-for-transformation/competent-cells-applications/comp-cells-for-protein-expression.html
    · https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/technical-documents/technical-article/protein-biology/protein-purification/optimizing-purification-of-histidine-tagged-proteins
    · https://www.rockland.com/resources/tips-for-optimizing-protein-expression-and-purification/
  • AI와 토픽 톺아보기

    • 1. Ni-NTA Agarose를 이용한 단백질 정제
      Ni-NTA Agarose는 His-tag 단백질 정제에 매우 효과적인 친화성 크로마토그래피 방법입니다. 이 기술은 높은 특이성과 빠른 정제 속도를 제공하며, 비용 효율적입니다. 그러나 비특이적 단백질 결합을 최소화하기 위해 적절한 완충액 pH와 이미다졸 농도 조절이 중요합니다. 또한 Ni2+ 이온의 누출을 방지하기 위해 정기적인 컬럼 유지보수가 필수적입니다. 대규모 정제에서는 비용 대비 효율성이 우수하며, 자동화 시스템과의 호환성도 좋아 산업적 응용에 적합합니다.
    • 2. 단백질 발현 시스템 및 Expression Cell
      다양한 발현 시스템(박테리아, 효모, 곤충, 포유동물 세포)은 각각의 장단점을 가지고 있습니다. 박테리아는 빠르고 저렴하지만 단백질 폴딩 문제가 발생할 수 있고, 포유동물 세포는 복잡한 단백질 수정을 제공하지만 비용이 높습니다. 선택은 목표 단백질의 특성, 필요한 수정, 예산 및 시간 제약을 고려해야 합니다. 최근 곤충 세포와 무세포 시스템의 발전으로 더 많은 선택지가 생겼으며, 각 시스템의 장점을 활용한 최적의 선택이 중요합니다.
    • 3. 단백질 발현 최적화 및 문제 해결
      단백질 발현 최적화는 배양 조건, 유도제 농도, 온도, pH 등 다양한 변수를 체계적으로 조절하는 과정입니다. 포함체 형성 문제는 발현 온도 저하나 유도제 농도 감소로 해결할 수 있으며, 독성 단백질의 경우 유도 가능한 프로모터 사용이 효과적입니다. 발현량 증가를 위해 코돈 최적화, 강력한 프로모터 선택, 숙주 균주 변경 등을 고려할 수 있습니다. 문제 해결은 체계적인 접근과 실험 설계가 필수이며, 작은 규모의 스크리닝부터 시작하는 것이 효율적입니다.
    • 4. Fusion Protein Tag를 이용한 단백질 정제
      Fusion protein tag(His-tag, GST, MBP 등)는 단백질 정제를 크게 단순화하는 강력한 도구입니다. His-tag는 작고 효율적이며, GST는 용해도 증가에 도움이 되고, MBP는 단백질 안정성을 향상시킵니다. 그러나 tag가 단백질의 기능이나 구조에 영향을 미칠 수 있으므로 신중한 선택이 필요합니다. 필요시 protease를 이용한 tag 제거가 가능하지만 추가 정제 단계가 필요합니다. 다중 tag 조합 사용도 정제 효율을 높일 수 있는 전략이며, 각 tag의 특성을 이해하고 목적에 맞게 선택하는 것이 중요합니다.
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