단백질의 분리와 분석( 1-D 전기영동 )

소개

단백질의 기본적인 개념과 단백질의 분리정제에 대해서 이해하고, 단백질의 분리의 가장 일반적인 방법인 1-D 전기영동 실험을 이용하여 목적하는 단백질의 분리 및 단백질체학(proteomics)의 기본적인 지식을 배양하도록 한다.

목차

1. 실험목적
2. 이론
1) 아미노산(Amino acid)
- 아미노산의 구조
- 아미노산의 분류
2) 단백질(protein)
3) 단백질의 분류
4) 단백질의 합성
5) 단백질의 분류
6) 단백질의 분리 방법
7) 크로마토그래피
8) 전기영동
9) 실험방법
10) Data & results
11) Reference

본문내용

8) 전기영동
단백질을 분리하는 또 다른 중요한 방법은 하전된 단백질의 전장(electric field) 내에서의 이동에 기초한 방법으로 전기영동법(electrophoresis)이라고 부른다. 이 방법은 단백질을 대량으로 정제하는 데는 그렇게 많이 사용되지 않는다. 즉, 이를 위해서는 좀더 간단한 방법이 흔히 사용되는데 전기영동법은 간혹 단백질을 불활성화하기 때문이다. 그러나 전기영동은 분석 방법으로서는 특히 유용하다. 이 방법이 유리한 점은 단백질이 분리될 뿐 아니라 눈으로 볼 수 있게 할 수 있으므로, 혼합물 중의 단백질의 수 또는 특정 단백질의 조제의 순도를 연구자가 재빨리 예견할 수 있는 것이다. 또한 전기영동에 의해서 등전점(isoelectric point)과 대략적인 분자량(molecular weight)과 같은 단백질의 중요한 성질을 결정할 수 있다.
단백질의 전기영동은 가교 중합체(cross-linked polymer)인 폴리아크릴마이드(polyacrylamide)로 되어 있는 겔(gel)중에서 한다. 폴리아크릴마이드 겔(polyacryl
-amide gel)은 분자의 체(molecular sieve)로서 작용하고 정량 또는 그들의 분자량에 대한 전하의 비에 비례해서 단백질의 이동을 늦추게 된다. 이 폴리아크릴아미드 젤의 농도가 증가할수록 구멍의 크기가 작아지므로 분리하고자 하는 단백질의 분자량을 알아서 폴리아크릴아미드 겔의 농도를 정한다.
이동은 단백질의 형태에 의해서도 영향을 받는다. 전기영동에 있어서 거대분자를 이동시키는 힘은 전위, E가 된다. 분자의 전기영동의 이동도, μ는 전위에 대한 입자의 속도, V의 비가 된다. 전기영동의 이동도는 또한 분자의 실 전하, Z를 마찰계수, f로 나눈 것과 같다. 즉,
전기영동의 과정 중의 겔 상태에서의 단백질의 이동은 단백질의 크기와 모양에 의해 결정된다.
SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
폴리아크릴아미드 젤은 분자체(molecular sieve)의 역할을 하므로 각 단백질은 거의 그들의 질량에 비례하여 이동한다. 그러나 단백질을 이루는 대부분의 아미노산이 띄는 전하량의 정도가 다르기 때문에 단위 질량당 전하의 정도가 달라지고, 단백질 분자의 모양도 다양하여 그들의 이동속도를 예상하는 것은 간단하지가 않다. 따라서 단백질의 순도의 분석 및 분자량의 결정을 위한 전기영동은 음이온 세제인 sodium dodecyl sulfate(SDS)와 디설파이드 결합(S-S bond, disulfide bond)을 끊는 2-Mercaptoethanol을 단백질 용질에 첨가해 줌으로써 가능하다.
2-Mercaptoethanol의 구조
① 각 단백질이 가지고 있는 전하량과 분자의 모양이 다양함.
② SDS는 단백질에 결합하여 원래의 전하에 관계없이 단백질 분자량에 비례하는 양만큼 음전하를 가짐.
③ SDS의 결합으로 단백질의 고유한 3차 구조를 잃고 linear 상태로 바뀜으로 순전히 분자 량에 따라 분리가 됨.
이와 같이 SDS를 이용한 전기영동은 질량(분자량)의 크기에 따라 큰 폴리펩티드는 늦게 이동하고 작은 폴리펩티드는 빨리 이동되는 영동상을 볼 수 있는 것이다. 그러므로 단백질의 분리과정을 확인해 볼 수 있을 뿐만 아니라, 이들 단백질의 이동도가 각 분자량의 대수값에 비례하므로 분자량을 이미 알고 있는 표식단백질과 비교하여 분자량을 산출해 낼 수 있다
즉, 순도와 분자량을 추정하는데 일반적으로 이용되는 전기영동법은 계면활성제인 도데실 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS)을 사용한다. SDS는 대부분의 단백질과 아니노산 2개의 잔기당 약 1분자의 SDS의 비율로, 단백질과 거의 비례하는 양으로 결합한다. 결합한 SDS는 큰 실(net)의 마이너스 전하를 띠게 되며, 단백질 고유의 전하를 의미 없게 한다. 또한 SDS가 결합을 하면 단백질 본래의 고차원구조가 변화되어 대부분의 단백질은 매우 비슷한 형으로 되며, 매우 유사한 질량당의 전하비를 가지게 된다. 따라서 SDS 존재하에서의 전기영동은 보다 작은 폴리펩티드를 보다 빠르게 이동시키도록 원래의 질량에 의해서 단백질을 분리하는 것이다.
등전점 전기영동(isoelectric focusing)
등전점 전기영동은 단백질의 등전점(isoelectric point,PI)을 결정하기 위하여 사용되는 방법이다. 저분자량의 유기산과 염기의 혼합물은 겔을 가로질러서 생긴 전장 내에 분배시킴으로써 pH 구배가 형성된다. 단백질의 혼합물이 전개되면, 각 단백질은 그의 pI와 일치하는 pH에 도달할 때까지 이동한다. 이와 같이 함으로써 서로 다른 등전점을 가지고 있는 단백질은 겔 중에서 여러 가지로 분배된다.
등전점 전기영동법 (isoelectric focusing)
2차원 전기영동법(two-dimensional electrophoresis)
등전점 전기영동법과 SDS 전기영동을 순차적으로 결합시키는 2차원 전기영동은 단백질의 복잡한 혼합물을 분석할 수 있다. 이것은 등전점 전기영동 또는 SDS 전기영동을 단독으로 하는 것보다도 더 감도가 높은 분석법이 된다. 2차원 전기영동은 서로 다른 pI를 가지고 있는 같은 분자량의 단백질, 또는 아주 유사한 pI를 가지고 있으나 분자량이 다른 단백질을 분리할 수 있다. 5)
< Gel의 농도(%T)와 marker 단백질 이동도SDS-PAGE의 분리 gel에는, 일반적으로 5-15%T의 gel이 이용되어 진다. 분획 범위는 %T로 결정된다. >
< Standards Protein의 분자량 분포 >

참고자료

· 없음