아미노산의 적정

소개

Introduction
1. 실험 목적
- 단백질 지도를 만들기 위해서는 추출된 단백질을 gel에서 2차원적으로 분리하는 방법이 많이 사용된다. 이 때 한 차원에서는 sodium dodecylsulfate-polyacrylammide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분자량에 따라 분리하고, 다른 차원에서는 이와는 수직 방향으로 isoelectric focusing 방법을 사용한다. SDS-PAGE에서는 모든 단백질 표면에 음전기를 가지는 계면활성제(anionic surfactant)인 SDS를 달라붙게 하고 전기장 하에서 3차원적으로 그물 구조를 가진 gel을 통하여 양극으로 움직이게 한다. 분자량이 작은 단백질은 빨리 움직이고 분자량이 큰 단백질은 느리게 움직이기 때문에 분리가 일어나는 것이다.
- 아미노산의 pKa는 수용액 내의 짝산과 짝염기의 농도가 같을 때의 pH라는 것은 Henderson - Hasselbalch equation을 살펴보면 알 수 있다. 적정곡선 상에서 보면 염기를 가하여도 pH가 그다지 변화하지 않는 변곡점에서의 pH가 아미노산의 pKa이다. 이렇게 아미노산 용액을 염기성 용액으로 적정하면 적정곡선을 통해서 당량점과 pKa를 찾을 수 있다.
오늘 실험에서는 aspartic acid, phenylalanine, lysine 세 가지 아미노산에 대하여 NaOH 용액으로 적정한 그래프를 얻어, 각 아미노산의 pKa값과 당량점을 구하고 실험에 쓰인 아미노산을 알아낸다.
2. 실험의 배경지식
1) Isoelectric focusing 이란?
- pI값에 의해서 단백질을 펼치는 방법으로 1975년 O`Farrell에 의해서 개발 [O`Farrell (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. JBC 250, 4007-4021]
① IEF의 한계
- Gel에 loading 할 수 있는 단백질양이 적다 : spot을 찾더라도 분석이 불가능
- 재현성이 낮다.
② IEF 한계의 극복 : IPG (immobilized pH gradient gel)
- Gel에 loading할 수 있는 단백질의 절대량이 약 100배 증가 (mg 단위)
- IPG gel strip이 상품화 : 재현성이 증가
③ IPG란
- pH gradient를 만드는 물질을 immobiline이라는 zwitter ion을 사용
- Immobiline을 함유한 polyacrylamide gel : IPG strip
- 단백질의 위치가 ampholyte의 배치에 따라 달라지는 것을 막을 수 있다. 1)

목차

Introduction
1. 실험 목적
2. 실험의 배경지식
Reagents
1) 페닐알라닌(phenylalanine)
2) 아스파르트산(aspartic acid)
3) 라이신(lysine)
Experimental Procedure
1) 실험 기구 및 시약
2) 실험 방법
Results and Discussion
1) Results
2) Discussion
Conclusion

본문내용

Introduction
1. 실험 목적
- 단백질 지도를 만들기 위해서는 추출된 단백질을 gel에서 2차원적으로 분리하는 방법이 많이 사용된다. 이 때 한 차원에서는 sodium dodecylsulfate-polyacrylammide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분자량에 따라 분리하고, 다른 차원에서는 이와는 수직 방향으로 isoelectric focusing 방법을 사용한다. SDS-PAGE에서는 모든 단백질 표면에 음전기를 가지는 계면활성제(anionic surfactant)인 SDS를 달라붙게 하고 전기장 하에서 3차원적으로 그물 구조를 가진 gel을 통하여 양극으로 움직이게 한다. 분자량이 작은 단백질은 빨리 움직이고 분자량이 큰 단백질은 느리게 움직이기 때문에 분리가 일어나는 것이다.
- 아미노산의 pKa는 수용액 내의 짝산과 짝염기의 농도가 같을 때의 pH라는 것은 Henderson - Hasselbalch equation을 살펴보면 알 수 있다. 적정곡선 상에서 보면 염기를 가하여도 pH가 그다지 변화하지 않는 변곡점에서의 pH가 아미노산의 pKa이다. 이렇게 아미노산 용액을 염기성 용액으로 적정하면 적정곡선을 통해서 당량점과 pKa를 찾을 수 있다.
오늘 실험에서는 aspartic acid, phenylalanine, lysine 세 가지 아미노산에 대하여 NaOH 용액으로 적정한 그래프를 얻어, 각 아미노산의 pKa값과 당량점을 구하고 실험에 쓰인 아미노산을 알아낸다.
2. 실험의 배경지식
1) Isoelectric focusing 이란?
- pI값에 의해서 단백질을 펼치는 방법으로 1975년 O`Farrell에 의해서 개발 [O`Farrell (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. JBC 250, 4007-4021]
① IEF의 한계
- Gel에 loading 할 수 있는 단백질양이 적다 : spot을 찾더라도 분석이 불가능
- 재현성이 낮다.
② IEF 한계의 극복 : IPG (immobilized pH gradient gel)
- Gel에 loading할 수 있는 단백질의 절대량이 약 100배 증가 (mg 단위)
- IPG gel strip이 상품화 : 재현성이 증가
③ IPG란
- pH gradient를 만드는 물질을 immobiline이라는 zwitter ion을 사용
- Immobiline을 함유한 polyacrylamide gel : IPG strip
- 단백질의 위치가 ampholyte의 배치에 따라 달라지는 것을 막을 수 있다. 1)

참고자료

· 1) http://hykim.chungbuk.ac.kr/projects/plant/proteome.htm
· 2), 6) http://mml.chungbuk.ac.kr/suup/2003/단백질 정제_김승렬.hwp
· 3) www.sungka.com/technote/main.cgi/esblaac.hwp?...filename=esblaac.hwp
· 4) www.khp.ac.kr/study/분석제9주%20강의내용.hwp
· 5) http://khweb.kyunghee.ac.kr/~ahelixer/html/basic/pa0003.html
· 7), 8), 9) empas 백과사전
· 10) http://www.shingu-c.ac.kr/~dolchoi/lc_bc/bc3-1.html