Chromosomal DNA isolation of E.coli(대장균) Gene manipulation using PCR

소개

실험실습과정
Chromosomal DNA isolation of E.coli(대장균) 방법
Gene manipulation using PCR

목차

1.Introduction
☀ DNA, RNA 분리
☀ Plasmid DNA의 분리 및 정제방법
☀ Polymerase Chain Reaction 개요
2. PCR 단계
☀ PCR에 필요한 시약
3. Primer
☀ PCR을 이용하여 DNA 변형시키기
4. Chromosomal DNA isolation of E.coli
☀ Polymerase Chain Reaction
5. Results

본문내용

☀ DNA, RNA 분리
- (1) 세포 내 전체 DNA의 분리 정제
① 세균을 배양하여 수거한다.
② 세포추출물을 위해 세포를 파괴한다.
③ 세포추출물로부터 DNA를 정제한다.
④ DNA를 농축시킨다.
- (2) RNA분리 정제
전형적인 포유동물세포는 약 10-5g의 RNA를 함유하고 있다. 이중 80～85%는 ribosomal RNA (주로 28S, 18S, 5S)이며 10～15%는 여러 종류의 소분자 RNA(transfer RNA, small nuclear RNA 등)이다. 이런 RNA들은 제각기 정해진 크기와 일정한 염기 배열 순서로 되어 있으며 전기영동이나 밀도구배 원심분리(density gradient centrifugation) 혹은 ion exchange chromatography등의 방법으로 순수분리 할 수 있다.
반면 mRNA는 세포내 전체 RNA중 1～5% 정도를 차지하고 있으며 크기(수백개에서 수천개 염기)와 염기배열 순서가 다양하다. 그러나 거의 모든 포유동물의 mRNA에는 3`쪽 끝에 poly(A) tail이 있어 oligo(dT) cellulose를 이용한 affinity chromatography로 순수 분리할 수 있다. 세포로부터 RNA를 원형대로 분리하기 위해서는 RNase의 작용을 최소화하 는 것이 가장 중요하다. RNase는 여러 형태의 물리적 작용에 저항성이 있지만 4M guanidine isothiocyanate와 환원제인 -mercaptoethanol 용액 내에서는 불활성화된다. 또한 대부분의 단백질 역시 guanidine chloride나 guanidinium isothiocyanate와 같은 강력한 변성제 용액에 쉽게 녹는다. 단백질의 정렬된 2차 구조가 소실됨에 따라 세포구조가 붕괴되고 RNA나 DNA에 결합된 단백질 역시 핵산으로부터 분리된다. 따라서 이들 시약을 이용하여 RNA를 분리하면 RNase가 풍부한 췌장조직에서도 완전한 형태의 RNA를 분리할 수 있다.

참고자료

· - Michael T.Madigan, John M.Martinko, Jack Parker / Brock Biology of Microorganisms / Prentice Hall / 10th edition / 2001
· - Hugh G. Griffin, Annete M. Griffin / PCR technology - Current Innovations / CRC Press / 1994
· - Kary B. Mullis, Francois Ferre, Richard A. Gibbs / The Polymerase Chain Reaction / Birkhauser / 1994