[생물 식물 실험]고추에서 ca-XET-3 유전자 분리 및 형질전환체 제작

소개

실험에서 XET의 형질전환체가 water stress에 매우 저항성을 가진다는 이전의 논문에 기초하여, 고추에서 얻은 ca-XET3 유전자를 Arabidopsis에 형질전환 하여 drought와 rewatering에 어떠한 phenotype 보이는지 실험하기로 하였다. 그리고 왜 세포벽의 신장과 loosening, 그리고 remodeling에 관여하는 XET가 drought에도 생리적인 표현형이 영향을 끼치는지 고찰해 보았다.

목차

제 1장 서론

제 2장 XET의 cDNA 분리하기
2.1 실험 재료 및 방법
2.11 RNA extraction from Plant tissues
2.12 reverse transcription & PCR
2.13 transformation into E.coli & miniprep.
2.14 autonomic DNA sequencing
2.2 실험결과
2.21 RNA 정량
2.22 RNA gel running
2.23 RT-PCR gel running
2.24 colony plate 사진
2.25 colony의 scale up과 minipreparation 확인 사진
2.26 autonomic DNA sequencing
2.3 고찰

제 3장 식물의 형질전환체 만들기
3.1 실험 재료 및 방법
3.11 transfer to Binary vector & transformation into E.coli & miniprep.
3.12 transformation into agrobacteria by electroporation & colony PCR
3.13 transformation into Arabidopsis & harvesting & planting
3.14 basta screening & genomic PCR
3.2 실험결과
3.21 pBC302-3 vector를 가진 E.coli minipreparation 확인
3.22 Colony PCR gel running 사진
3.23 harvest 한 씨앗 및 basta screening에 의한 새싹 사진
3.24 genomic PCR
3.3 고찰

제 4장 water stress에 대한 형질전환체의 연구 20쪽
4.1 drought stress experiment
4.2 실험결과
4.3 고찰

제 5장 종합 고찰
제 6장 참고문헌

본문내용

식물은 세포차원에서 볼 때 많은 점에서 동물과는 다른 차이점을 가지고 있다. 그중에서도 특히 세포벽이란 구조는 동물세포에는 존재하지 않는 것이다. 동물과 같이 외골격이나 내골격이 없는 식물은 세포 하나하나가 세포벽이라는 구조를 가지고 있어서 식물체 전체의 지지역할을 한다. 지지역할 이외에도 세포벽은 분비, 수송, 세포 신장에 관련된 기능들을 하고 있다.
세포벽의 구성은 위 그림에서와 같이 glucose의 β-1,4 linked glucan을 기본 단위로 하는 cellulose가 기초를 이룬다. 이러한 cellulose가 다발을 이루어 직경이 10~25nm인 microfibril을 형성한 뒤, 다시 microfibril이 다발을 이루어 직경이 0.5μm이고, 길이가 4μm인 macrofibril을 만든다. 이런 세포벽의 골격을 이루는 microfibril의 사이사이에는 hemicellulose와 pectin등의 기질 분자들이 끼어 들어가 교차되어 연되어있다. 이런 hemicellulose와 pectin는 벽돌 속의 시멘트 같은 역할을 한다.
이번 실험에서 연구하고자 하는 XET(Xyloglucan EndoTransglycosylase)는 바로 이러한 세포벽에서 작용하는 효소이다. hemicellulose의 대표적인 물질인 xyloglucan은 microfibril과 수소결합을 이루고 있어, 구조를 단단하게 하는데, XET는 바로 이 xyloglucan과 microfibril의 수소결합을 자르거나, 또는 새로운 수소결합을 결합을 촉진함으로써 세포벽 loosening에 기여하고 있다. 바로 이러한 세포벽의 느슨함은 세포의 신장에 선행되어야 할 조건이므로, XET가 식물체에서 없어서는 안 될 중요한 효소임을 알 수 있겠다. 위 그림과 같이 기존의 xyloglucan chain을 자르는데, 그때에 만약 세포에 큰 팽압이 작용하고 있다면, 그림 B와 같이 세포벽의 공간이 늘어날 것이다. 그리고 다시 XET의 작용으로 non-reducing end를 가진 새로운 xyloglucan과 기존의 잘려진 xyloglucan이 연결되면, 세포벽은 그림 C와 같이 확장되게 되는 것이다.
지금까지 토마토, 벼, Arabidopsis 등을 포함한 많은 쌍자엽, 단자엽 식물체에서 XET 유전자가 분리되었고 , 식물체들이 많은 XET-gene-family를 가지고 있음이 알려졌다. 이들은 C- terminus 이외의 부위에서 상당한 염기서열의 유사성을 지니고 있다. 식물체의 XET는 Bacillus β- glucanases에 존재하는 DEIDFEFLG 아미노산 motif를 가지며, 이 부위는 xyloglucan backbone의 β- 1,4 linkage를 절단하는 효소 활성을 위해 중요한 부위이다. 또 하나의 특징은 N- linked glycosylation site와 C- terminus 부위에 disulfied 결합을 이룰 수 있는 여러 개의 cystein residue가 존재하는 것이며 이로 인해 XET 효소 활성이 조절되어진다............

참고자료

· 김지은, [고추에서 water stress에 의해 유도되는 ca-XETs 유전자들의 발현양상 분석과 형질전환체 제작], 연세대학교 생물학과 대학원, 2003년
· 윤혜섭, [식물에서 vrXET1 유전자의 발현조절과 그 역할에 관한 연구], 연세대학교 생물학과 대학원, 2001년
· Chengbin Xiang, [A mini binary vector series for plant transformation],Plant Molecular Biology 40: 711-717, 1999.
· 이규배, [식물형태학], 라이프사이언스
· Lodish, Berk, Matsudaira등, [molecular cell biology], freeman
· Shabir Najmudin, [XYLOGLUCAN IS RECOGNISED BY CARBOHYDRATE-BINDING MODULES THAT BIND TO β-GLUCAN CHAINS], JBC Papers in Press. Published on November 28, 2005