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[A+] 2024 서강대 현대생물학실험2 4차 (site directed mutagenesis)

"[A+] 2024 서강대 현대생물학실험2 4차 (site directed mutagenesis)"에 대한 내용입니다.
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최초등록일 2025.06.29 최종저작일 2024.12
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[A+] 2024 서강대 현대생물학실험2 4차 (site directed mutagenesis)
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    • 💡 DNA sequencing 및 유전자 변형 기술에 대한 심층적 이해

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    소개

    "[A+] 2024 서강대 현대생물학실험2 4차 (site directed mutagenesis)"에 대한 내용입니다.

    목차

    1. Abstract
    2. Introduction
    3. Materials & Methods
    4. Results
    5. Discussion
    6. References

    본문내용

    이번 실험에서는 DNA의 특정 부분에 돌연변이를 일으키는 site-directed mutagenesis를 통해 pGFPuv에 Y66H와 Y145F mutation을 도입하고 BL21 competent cell에 transformation하여 colony의 형광을 관찰하였다. pGFPuv는 UV 조사 시에 많은 형광을 내도록 변형된 GFPuv를 포함하는 plasmid이다. GFP의 chromophore는 65Ser – 66Tyr – 67Gly 서열에 의해 형성되며 145Tyr은 chromophore와 상호작용한다. Y66H와 Y66H/Y145F mutation은 모두 파란색 형광을 방출하도록 하며 Y66H/Y145F에 의한 형광이 Y66H보다 더 진한 파란색으로 관찰된다. 실험결과, mutation을 도입한 colony에서도 초록색 형광을 나타내는 colony가 관찰되는데 이는 template DNA가 메틸화되어 있지 않은 A를 포함하는 5’-GATC-3’ 서열을 갖기 때문이다. Y66H mutation에서 파란색 형광이 관찰되지 않고 초록색 형광만이 관찰된 것은 mutation을 도입하는 PCR 과정에 문제가 있었거나 나타난 colony의 수가 매우 적은 것으로 보아 transformation 과정에 문제가 있었을 것으로 예상할 수 있다. 또한, DNA sequencing을 통해 얻은 염기서열의 open reading frame을 찾고 nucleotide BLAST, protein BLAST로 분석했다. Nucleotide BLAST 결과 SGFP2와 99.17%의 유사도를 보였으며 그동안 실험에 사용했던 유전자가 239개의 아미노산으로 이루어진 GFP superfamily의 단백질을 암호화한다는 것을 확인할 수 있었다.

    참고자료

    · Dave Nelson, Michael Cox (2021), Lehninger principles of biochemistry, 8th, W. H. Freeman, pp. 1013~1015
    · Neil A. Campbell (2017), Biology A Global Approach, 11th, Pearson, pp. 448~452
    · Geoffrey M. Cooper (2019), The Cell: A Molecular Approach, 8th, Oxford University Press, pp. 308~310

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    • 1. Site-directed Mutagenesis
      Site-directed mutagenesis is a powerful molecular biology technique that enables precise modification of specific DNA sequences. This method is invaluable for studying protein function, improving enzyme properties, and creating disease models. The technique has evolved significantly from its inception, with modern approaches like QuikChange and CRISPR-based methods offering improved efficiency and accuracy. The ability to introduce targeted mutations allows researchers to understand structure-function relationships at the molecular level. However, the technique requires careful primer design and optimization to minimize off-target mutations. Despite these challenges, site-directed mutagenesis remains essential for synthetic biology, protein engineering, and fundamental research applications.
    • 2. GFP와 Chromophore 구조
      Green Fluorescent Protein and its chromophore represent a remarkable discovery that revolutionized biological imaging. The chromophore, formed through autocatalytic cyclization of three amino acids (Ser65-Tyr66-Gly67), demonstrates nature's elegant solution for fluorescence generation without requiring external cofactors. Understanding GFP's chromophore structure has enabled development of numerous fluorescent variants with different spectral properties. The structural insights have facilitated protein engineering to create improved versions with enhanced brightness and photostability. GFP's discovery earned the Nobel Prize, highlighting its significance in modern biology. The chromophore's unique properties continue to inspire development of new biosensors and imaging tools, making it fundamental to contemporary cell biology and biomedical research.
    • 3. DNA Sequencing 기술
      DNA sequencing technology has undergone revolutionary transformations, from Sanger sequencing to next-generation sequencing platforms. Modern sequencing enables rapid, cost-effective determination of genetic information, democratizing genomic research. High-throughput sequencing has accelerated discoveries in genomics, transcriptomics, and metagenomics. The decreasing costs have made whole-genome sequencing accessible for clinical diagnostics and personalized medicine. However, challenges remain including handling massive data volumes, ensuring accuracy in repetitive regions, and interpreting variants of uncertain significance. Long-read sequencing technologies are addressing some limitations of short-read methods. The continuous advancement of sequencing technology promises deeper insights into genetic diversity, disease mechanisms, and evolutionary biology, making it indispensable for modern biological research.
    • 4. Transformation과 Selection
      Transformation and selection are fundamental techniques for introducing foreign DNA into cells and identifying successfully transformed organisms. These complementary processes are essential for genetic engineering, creating transgenic organisms, and producing recombinant proteins. Transformation methods vary depending on cell type, including chemical competence, electroporation, and microinjection, each with specific advantages. Selection strategies using antibiotic resistance markers or fluorescent proteins enable efficient identification of transformed cells. The combination of these techniques has enabled creation of genetically modified crops, production of therapeutic proteins, and development of disease models. Modern approaches increasingly employ selectable markers that minimize environmental concerns. Despite their widespread use, optimization remains necessary for different organisms and applications, making transformation and selection critical skills in molecular biology and biotechnology.

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