서울대학교_물리분석실험_FRET(2024)

소개

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목차

1. Abstract

2. Introduction
1) 이론적 배경
2) 실험 기구 및 방법

3. Results

4. Discussion

5. Assignment

6. Reference

본문내용

이번 실험에서는 TCSPC(time correlated single photon counting)을 이용해 DNA에 표지된 형광의 세기와 수명을 측저앟고 FRET efficiency를 계산, accpetor dye와 donor dye 사이의 거리에 따른 변화를 이해하는 것을 목표로 한다. FRET(Forster resonace energy transfer)은 두 dye 사이의 non-radative energy transfer로, donor dye가 들 뜬 상태가 되면 acceptor dye에게 에너지를 전달한 뒤 바닥 상태로 돌아가는데 이 때의 방출 스펙트럼을 측정하여 정보를 얻는다. FRET efficiency는 실험적으로 측정되며 이로 부터 두 색소 사이의 거리를 계산할 수 있다. 반대로, TCSPC(Time correlated single photon counting)를 이용해 형광 lifetime을 측정하면 이를 이용해 FRET efficiency를 계산할 수 있다.
Donor only spectrum의 경우 565nm에서만 형광 피크가 나타났다면, Cy3-Cy5표지 dsDNA(t0)의 경우 FRET이 일어나 565nm에서 약한 형광 피크(donor dye), 665nm에서 강한 형광 피크(acceptor dye)가 측정됐다. 반면 Cy3-Cy5표지 dsDNA(t30)의 경우 두 dye사이간 거리가 멀어 FRET이 덜 일어나 565nm에서 강한 형광 피크, 665nm에서 약한 형광 피크가 측정됐다. TCSPC로 측정한 형광 lifetime은 t0가 0.439ns, t30은 0.6163ns 로, 이를 이용해 계산한 FRET efficiency는 각각 0.684, 0.0999이다.
FRET efficiency 이론값과는 상당한 차이가 발생했는데 dye 분자 자체의 크기 때문에 거리가 멀어져서 오차가 생겼거나, t30의 경우 30개의 base로 이루어진 single strand DNA가 flexible 하여 접히고 꼬여서 발생했을 수 있다.

참고자료

· Benjamin Schuler, Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer, Journal of Nanobiotechnology, 2013
· Son, H., Mo, W., Park, J., Lee, J. W., & Lee, S. Single-Molecule FRET Detection of Sub-Nanometer Distance Changes in the Range below a 3-Nanometer Scale. Biosensors, 10(11), 168., 2020
· Helms V "Fluorescence Resonance Energy Transfer". Principles of Computational Cell Biology. Weinheim: Wiley-VCH. (2008). p. 202
· Andrews DL, Bradshaw DS "Virtual photons, dipole fields and energy transfer: A quantum electrodynamical approach" European Journal of Physics. 25 (6): (2004). 845–858