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리포트 / 자연과학

Restriction enzyme reaction과 Ligation (A+ 평가자료)

Restriction enzyme reaction, DNA Clean up, Ligation으로 Recombinant DNA를 만들고, Recombinant DNA (Plasmid)를 이용해 TOP10 cell에 Transformation하고, Kanamycin을 처리한 배지에 배양하여 Transformation이 제대로 이루어졌는지 확인하는 실험을 진행했습니다. 제한 효소 처리에 필요한 조건, Ligation 과정에서의 비율을 설정하는 방법, Ligase 역할, 등을 탐구해보았고, Cloning 후 selection 과정에 대해 Project에 기재하였습니다. A+ 평가 받았습니다.
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최초등록일 2023.05.25 최종저작일 2022.04
제한효소 restriction enzyme ligation Recombinant DNA
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Restriction enzyme reaction과 Ligation (A+ 평가자료)
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    소개

    Restriction enzyme reaction, DNA Clean up, Ligation으로 Recombinant DNA를 만들고, Recombinant DNA (Plasmid)를 이용해 TOP10 cell에 Transformation하고, Kanamycin을 처리한 배지에 배양하여 Transformation이 제대로 이루어졌는지 확인하는 실험을 진행했습니다.
    제한 효소 처리에 필요한 조건, Ligation 과정에서의 비율을 설정하는 방법, Ligase 역할, 등을 탐구해보았고, Cloning 후 selection 과정에 대해 Project에 기재하였습니다.
    A+ 평가 받았습니다.

    목차

    1. Title
    2. Purpose
    3. Material
    4. Method
    5. Results
    6. Discussion
    7. Projects
    8. Reference

    본문내용

    본 실험에서는 my product(clean up PCR product)와 pET28b를 이용하여 Enzyme cut, DNA clean up, Ligation 과정을 거쳐 Recombinant Plasmid (Ligation product)를 만들었다. 이어서 Ligation product를 TOP10 cell에 Transformation하여 Kanamycin처리한 배지에 배양하여 single colony를 관찰할 수 있었다.
    먼저, 실험 과정에서 사용된 Materials에 주목하여 실험 원리를 이해해 볼 수 있었다. 첫 번째로, pET28b Vector에 관하여 탐구해볼 수 있었다. 본 실험에서의 enzyme site가 NdeⅠ, XhoⅠ인 점을 고려하여, pET28b Vector를 이용하여 만든 recombinant plasmid 중 NdeⅠ, XhoⅠ를 enzyme site로 갖는 pET28b- hTIG3(1-132)를 예로 들어 비교해 보았다. pET28b- hTIG3(1-132)의 형태와 특징을 아래의 표로 정리해볼 수 있었고, 이를 통해 pET28b의 특징도 이해할 수 있었다.
    <표 1>에서의 pET28b-hTIG3(1-132)처럼 enzyme site는 NdeⅠ, XhoⅠ으로 동일한 것을 확인할 수 있었다. 이에 restriction enzyme NdeⅠ, XhoⅠ에 의해 절단된 말단부위의 특징과 restriction enzyme을 사용할 때의 반응조건에 관하여 탐구해보고, 본 실험 과정에 적용해 볼 수 있었다.위의 restriction enzyme의 인식부위를 고려하였을 때, Enzyme cut과정에서 사용한 Restriction enzyme NdeⅠ과 XhoⅠ는 sticky end를 형성한다고 판단할 수 있었다. sticky end는 제한 효소에 의하여 2~4개의 nucleotide를 엇물리게 절단하여 말단 부위에 형성되는 짧은 돌출 부위를 의미하고, Blunt end는 염기의 배열의 중간지점에 엇물리지 않게 이중가닥을 절단하여 생긴 말단 부위를 의미한다 . 이처럼 Enzyme cut에 사용되는 restriction enzyme은 특정 부위의 염기서열을 절단하면서 sticky end와 blunt end를 형성한다.

    참고자료

    · BioProduct (National Research & Development), 생물자원 연구성과 자원정보, pET28b-hTIG3(1
    · -132)
    · https://biorp.kribb.re.kr/view/resource/BP1429271
    · Enzynomics, Restriction enzyme, 제한효소 인식부위, (NdeⅠ, XhoⅠ)
    · https://www.enzynomics.com/shop/product_item.php?it_id=101006 (NdeⅠ)
    · https://www.enzynomics.com/shop/product_item.php?it_id=101007 (XhoⅠ)
    · T.A. Brown 저, 이병무 외 3인 역, 『유전자 클로닝과 DNA 분석 제 7판』, 월드사이언스, 2017, p. 30~31, 55
    · 김은중 외 7인 저, 『임상 분자생물학』, 고려의학, 2010, p. 81-83
    · Enzynomics, 「EZ-Pure™ PCR Purification Kit Ver. 2, Instruction Manual」, pp. 4~5
    · https://www.enzynomics.com/shop/product_item.php?it_id=801003
    · 「분자세포생물학백과」 (네이버 지식백과), 한국분자세포생물학회, DNA 연결효소
    · https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5569155&cid=61233&categoryId=61233
    · 남상욱, 권혁빈, 『유전공학의 이해』, 라이프사이언스, 2008, pp. 92~94, 97

  • AI와 토픽 톺아보기

    • 1. Restriction enzyme reaction
      Restriction enzyme reactions are a fundamental technique in molecular biology and genetic engineering. They allow for the precise cutting of DNA molecules at specific recognition sequences, enabling the isolation and manipulation of desired genetic sequences. This process is crucial for a wide range of applications, such as cloning, gene expression studies, and DNA analysis. The ability to use restriction enzymes to generate defined DNA fragments is a powerful tool that has significantly advanced our understanding of genetic mechanisms and facilitated numerous breakthroughs in biotechnology and medicine. While the underlying principles of restriction enzyme reactions are well-established, ongoing research continues to explore new enzymes, optimize reaction conditions, and develop innovative applications to further expand the capabilities of this essential technique.
    • 2. DNA Clean up
      DNA clean-up is a crucial step in many molecular biology protocols, ensuring the purity and quality of DNA samples for downstream applications. This process typically involves the removal of contaminants, such as salts, enzymes, and other impurities, that can interfere with subsequent experiments. Effective DNA clean-up methods, such as column-based purification, phenol-chloroform extraction, or magnetic bead-based separation, are essential for obtaining high-quality DNA that can be reliably used in techniques like PCR, sequencing, and cloning. The ability to efficiently purify DNA is a fundamental requirement for many research and diagnostic applications, and ongoing advancements in clean-up technologies continue to improve the speed, scalability, and versatility of this critical step in molecular biology workflows.
    • 3. Ligation
      Ligation is a fundamental process in molecular biology that involves the joining of DNA fragments through the formation of phosphodiester bonds. This technique is essential for the construction of recombinant DNA molecules, which are the foundation of genetic engineering and biotechnology. Ligation allows for the seamless integration of desired genetic sequences into vectors, enabling the expression, manipulation, and study of genes and proteins. The ability to ligate DNA fragments with high efficiency and specificity is crucial for a wide range of applications, including cloning, gene insertion, and the creation of transgenic organisms. Ongoing research in ligation methods, such as the development of improved DNA ligases and optimized reaction conditions, continues to enhance the reliability, precision, and versatility of this indispensable tool in the field of molecular biology.
    • 4. Transformation
      Transformation is a crucial process in molecular biology and genetic engineering, where foreign DNA is introduced into a host cell, such as bacteria or yeast, to enable the expression or replication of the introduced genetic material. This technique is essential for a wide range of applications, including the production of recombinant proteins, the study of gene function, and the development of genetically modified organisms. Effective transformation methods, such as heat shock, electroporation, or chemical-based approaches, allow for the efficient uptake and integration of plasmids or other DNA constructs into the host cells. The ability to reliably transform cells is a fundamental requirement for many research and biotechnological endeavors, and ongoing advancements in transformation technologies continue to improve the efficiency, scalability, and versatility of this critical process in molecular biology.
    • 5. pET28b vector
      The pET28b vector is a widely used expression system in molecular biology and protein engineering. It is a plasmid-based vector designed for the high-level expression of recombinant proteins in Escherichia coli (E. coli) host cells. The pET28b vector features a strong T7 promoter, which allows for the inducible expression of the target protein, and a variety of fusion tags, such as the His-tag, that facilitate the purification of the expressed protein. The versatility and reliability of the pET28b system have made it a popular choice for the production of a wide range of recombinant proteins, from enzymes and antibodies to therapeutic proteins and biopharmaceuticals. Ongoing research and development in vector engineering continue to expand the capabilities of the pET28b system, improving its efficiency, specificity, and compatibility with diverse protein targets and host organisms.

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      실험 절차와 원리를 체계적으로 설명하고, 결과 및 토의를 통해 실험의 의미와 배경 지식을 종합적으로 제공하고 있다.

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