경희대학교 생리유전학실험 - 미생물유전학 실험 최종 보고서(A+보고서)

목차

1. Introduction: molecular analysis of active domains in the Ferritin of Deinococcus geothermalis
2. Plasmid isolation & PCR (polymerase chain reaction)
3.DNA purification, Restriction enzyme digestion & Transformation
4. LB/LA 배지 제조 & Streaking(1, 2차)
5. Protein induction, Plasmid prep & DNA electrophoresis
6. Oxidative stress response & CFU Assay
7. SDS-PAGE

본문내용

철 이온은 생물에게 필수적인 요소이다. 다양한 생체 내 활동에 관여하며 그 농도에 따라 생명활동을 돕기도 하지만 치명적인 독이 되기도 한다. 다행히도, 많은 생물들이 철 이온의 농도 조절에 관여하는 단백질인 Ferritin을 가지고 있다. Ferritin은 세포 내 단백질이며 철을 산화하는 방식으로 그 내부에 철을 저장하거나 방출하여 세포 내 철 이온의 농도조절에 관여한다.
이 실험에서는 Deinococcus geothermalis 균주의 유전체에 존재하는 Ferritin의 유전자인 Dgeo_0281을 PCR SDM(PCR Site-Directed Mutagenesis)을 통해 Ferritin의 ferroxidase active center를 이루는 아미노산과 대응되는 DNA region의 sequence를 변화시켜보고, Oxidative stress condition에서의 Ferritin이 나타내는 작용특성을 분석하는 실험을 수행하였다. 전체적인 실험의 순서는 다음과 같다.

2주에 걸쳐 실험이 진행되었으며 파란 박스의 실험들은 첫 주에, 노란색 박스의 실험들은 두 번째 주에 진행되었다. 첫 주 실험은 SDM 시킨 Plasmid를 E. coli에 넣어 형질변환 시킨 후 배양하는 것이 주된 과정이다.
둘째 주 실험에서는 Ferritin의 철 저장 기능이 Oxidative stress response와도 관계가 있을 것이라 생각되어 HO condition에서 Ferritin이 over express된 cell과 일반 cell의 반응, 생존력의 차이를 살펴보았다.

⦁Objective
: 대장균으로부터 우리가 원하는 Plasmid를 정제한다. 정제한 Plasmid DNA을 PCR을 통해 증폭시킨다.

⦁Introduction
세균의 extrachromosomal DNA인 plasmid는 독자적으로 복제, 발현이 가능하다.

참고자료

· Biochemistry, 7th Edition / Berg, Tymoczko, Styler / W.H. FREEMAN AND CO./ 2012. 3. 6/ p. 74-75
· https://commons.wikimedia.org/wiki/File:SDS-2D-skeletal.png