Protein Quanitification by Bradford protein assay 예비

목차

1. 단백질 정량법
1) Lowry protein assay
2) Bradford protein assay

2. spectrophotometer의 원리

3. 단백질 전기영동과 DNA 전기영동의 차이점

4. 단백질 전기영동시 stacking gel과 resolving gel에서 pH를 각각 6.8과 8.8을 사용하는 이유

5. 단백질 전기영동에 사용되는 물질에 대한 이해
1) SDS (sodium dodecyl sulfate)
2) β-mercaptoethanol 및 dithiothreitol

6. 단백질 전기영동 예측

7. Reference

본문내용

1. 단백질 정량법
단백질 농도를 정량하는 방법은 크게 Animo acid analysis, Spectrometric method, Colorimetric method, Nitrogen analysis(Kjedahl) 4가지로 분류할 수 있다. 그 중 Colorimetric method에는 세부 시험 방법과 원리 등에 따라 Buret, Lowry, BCA, Bradford 방법으로 나눌 수 있다.

1) Lowry protein assay
Lowry method는 일반적으로 0.01~0.1mg/ml 범위의 단백질 농도 측정에 사용하며 두 단계로 색이 2번 변하는 반응이다. 1단계는 뷰렛반응으로 pH=10 정도의 알칼리 조건에서 단백 질 용액과 Cu2+를 반응시키면 Cu2+가 단백질의 펩티트 결합과 착화합물(complex)를 형성하며 Cu1+로 환원되어 용액이 보라색으로 변한다. 2단계는 폴리-시오칼토 반응(Folin-Ciocalteu reaction)이다. 1단계에서 생성된 착화합물이 노란색인 폴리-시오칼토 시약을 반응하면 방향족 아미노산은 산화되고 시약의 phosphomolybdotungstate는 heteropolymolybdenum으로 환원된다. 반응액은 진한 청색으로 변하고 500~750nm 파장에서 흡광도가 측정된다.
BSA(Bovine Serun Albumin)이나 BGG(Bovine Gamma Gloulin)과 같은 표준 단백질을 증류수로 희석하여 5~100㎍/ml 범위의 표준 희석액을 만든다. 이 희석액으로 lowry method 실험을 진행하여 회귀 직선을 구한다. 회귀 직선은 ‘Y = aX + b’의 형태인 일차 방적식으로 X는 표준 희석액의 단백질 함량, Y는 표준 희석액의 흡광도 그리고 a,b는 각각 기울기와 Y 절편을 나타낸다. standard curve를 구했다면 준비한 검액의 흡광도를 측정해 단백질 함량을 구한다. 검액 준비 시, 희석 과정이 있었다면 희석 배수를 곱하여 단백질 함량을 구한다.

참고자료

· https://www.cheric.org/files/education/cyberlecture/e200112/e200112-1001.pdf
· https://ko.wikipedia.org/wiki/%EB%B6%84%EA%B4%91%EA%B4%91%EB%8F%84%EB%B2%95
· https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=425229&cid=60261&categoryId=60261
· 윤경식.김호식 외 역, 레닌저 생화학 제 6판 2014
· Anlytical Chemistry An Introduction 7th edition/Skoog/Books.cole