생명과학실험 웨스턴블랏팅 Western blotting analysis

소개

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목차

1. 실험 목적 및 원리 (Introduction)
1) Membrane의 종류
2) Membrane에 protein이 붙는 원리
3) Transfer Buffer의 조성 / Methanol이 들어가는 이유
4) Blocking sulution BSA 와 Skim Milk의 차이
5) Antibody
6) Antibody의 상업적 용도

2. 실험 재료 및 실험 방법
1) 실험에 사용된 도구
2) 실험에 사용된 재료
3) 실험방법

3. 실험 결과 (Result)
1) 결과 분석

본문내용

Western Blotting은 샘플 내에 특정 단백질의 존재 여부, 단백질의 양과 크기 등을 확인하는 실험이다. SDS-PAGE진행하여 크기에 따라 분리된 단백질을 준비한다. 다음 목표 단백질에만 특이적으로 결합하는 항체와 항원항체 반응을 진행하여 시료 안에 목표 단백질이 존재하는지 검출한다.
지난번 주차 실험에서는 SDS-PAGE를 진행하여 gel 상에서 목표단백질의 band를 분석하여, 분리하고자 하는 단백질이 용출되었는 지 분자량을 통해 확인했다. 이번 실험에서는 gel 상에 나타난 protein band를 Electro-transfer를 통해 Membrane 상으로 옮긴 후 흡착시켰다. Membrane 표면의 목적 단백질과 항체와 결합시켜, 항원 항체반응을 통해 목표 단백질의 존재 여부를 더 정밀하게 파악할 수 있다.
지난 주차에서는 Naa30단백질을 목표단백질로 설정하여 SDS PAGE를 통해, Affinity 칼럼 크로마토그래피를 통해 목표 단백질이 잘 분리정제되었는 지 확인하였다. 이번 실험에서는 단백질 시료를 바꿔 AP단백질을 목적 단백질로 설정하여..

<중 략>

Membrane에 protein이 붙는 원리
단백질은 SDS로 인해 net charge가 (-)로 masking 되어있다. gel 방향에 (-)를 걸어주고membrane 방향에 (+) 전기장을 걸어주면, 단백질 시료는 척력과 인력의 상호작용을 이용하여 membrane 쪽으로 이동한다. 이 과정이 Electro Transfer과정이다. Membrane과 Protein의 Binding interacrion에 있어서 nitrocellulose membrane은 protein과 hydrophobic interaction을 하며, PVDF membrane은 protein과 hydrophobic interaction과 추가적으로 dipole interaction을 한다.

참고자료

· https://info.gbiosciences.com/blog/bid/203026/pvdf-or-nitrocellulose-which-membrane-is-best 검색일 2021.04.29.
· Campbell Biology (Campbell Biology Series) 11th Editionby Lisa Urry (Author), Michael Cain (Author), Steven Wasserman (Author), Peter Minorsky (Author), Jane Reece
· https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%9B%A8%EC%8A%A4%ED%84%B4_%EB%B8%94%EB%9E%8F 검색어 western blot. 검색일 2021.04.29.
· Molecular Biology of the cell sixth edition, Author Bruce Alberts.