GFP 단백질 정량과 SDS-PAGE 실험 레포트

소개

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목차

1. Abstract

2. Introduction
(1) GFP, EGFP
(2) 크로마토그래피
(3) SDS-PAGE
(4) extinction coefficient assay
(5) Lowry assay

3. Material and Method

4. Result
(1) elution된 EGFP
(2) extinction coefficient assay
(3) SDS-PAGE 결과
(4) BSA standard curve
(5) Spectrofluorometer정량의 결과

5. Discussion

본문내용

이번 실험의 목적은 EGFP를 발현, 정제, 측정하여 각각의 정제 방법을 통해 순수 목적 단백질을 채취하고 이를 여러 측정 방법을 동원하여 정량한 후 결과값을 비교해보는 실험이다. GFP는 약 510nm에서 녹색 형광을 방출하는 물질로 육안으로 확인이 가능하기에 실험에서 자주 사용된다. 우리가 사용하는 EGFP는 이를 활용하기 쉽게 변형시킨 것으로 excitation max는 488nm, emission max는 510nm로 알려져있다. 분광광도계와 Lambert-beer 식을 이용하여 구하는 Extinction coefficient assay, 표준곡선과 비교하여 농도를 구하는 Lowry assay, 단백질을 tagging하여 크기별로 비교하는SDS-page, 단백질의 excitation max와 emission max를 구하는 Spectrofluorometer을 측정하는데 이용했다. 실험방법으로는 먼저 실험 전날과 당일 오전에 배양하여 발현시키고 이를 크로마토그래피와 Ultrafilteration을 통해 정제한 후 앞서 설명한 네가지 측정 방법으로 정량한다. 실험결과 정제 후 황녹색의 형광을 띄는 EGFP를 확인할 수 있었고 이를 Extinction coefficient assay를 통한 측정값은 288nm에서 0.123mM, 480nm에서 0.094mM, ratio의 값은 131%이었다. SDS-page에서 28.3kDA값을 얻어 Extinction coefficient assay의 480nm에서의 질량농도 0.027mg/mol을 얻었다. Lowry assay에서 표준곡선과 비교하여 0.041mg/ml라는 질량농도를 구했는데 이는 앞서 구한 Extinction coefficient assay값과 다르다. 이는 분광광도계 사용시 cuvette에 의한 오차와 Lowry assay에서 다른 아미노산들에 의한 오차라고 생각된다.

참고자료

· 서강대학교 생명과학부 매뉴얼
· 김창홍 ,화학대사전1,서울 세화,2001,한국판