PCR &16S rRNA gene sequencing: DNA isolation, PCR을 통해 얻은 16S rRNA를 통해 균 동정

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Materials and Methods
4. Results
5. Discussion
6. Conclusion
7. References

본문내용

Abstract
미지의 균의 DNA를 추출하고 16s rRNA를 추출하기 위해 PCR을 진행해 DNA를 증폭시킨다. 이때 이용하는 primer는 16s rRNA 조각의 양 끝의 서열을 암호하는 것을 사용한다. PCR 후 전기영동의 band로 16s rRNA의 존재를 확인했다. sequencing을 하여 16s rRNA의 서열을 통해 균을 동정해서 MBLB 1396은 Phycicoccus aerophilus임을 알 수 있다.

Introduction
1. DNA isolation 원리
DNA를 추출하기 위해 크게 2단계로 나누어 진다. 세포를 파쇄하는 단계와 세포 내 여러 물질 가운데 DNA만을 선별하는 단계로 나뉜다. 세균을 배양하고 원심분리하여 pellet을 모은다. 물리적인 방법인 beadbeater와 화학적인 방법인 STES buffer을 이용해 세포막 및 세포벽을 부순다. 부서진 세포내 잔해 중 DNA만을 꺼내기위해 Phenol-Chloroform Isoamine의 하층액과 Chloroform을 이용해 화학적으로 DNA를 분리해 낸다.
2. PCR 원리
DNA의 원하는 부분을 복제 증〮폭하는 기술로 유전자의 발현이나 변이 확인하는데 사용된다. PCR은 denaturation, annealing, elongation의 3단계로 이루어져 있으며 온도를 조절하며 단계를 바꾼다. Denaturation에서는 92~95℃ 정도 가열하여 두 가닥의 DNA를 한 가닥의 DNA로 분리하는 과정으로 분리된 각각의 DNA는 Template DNA로 역할을 한다. 변성 온도는 DNA 내에 있는 G+C의 양과 DNA 길이에 따라 달라진다. Annealing에서 50~65℃로 온도를 낮추면 Primer의 염기서열에 상보적인 염기서열을 가지고 있는 Template DNA에 결합한다. 이 때 결합 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한요소로 온도가 너무 높다면 Primer가 Template DNA에 너무 약하게 결합되어서 증폭된 DNA의 양이 매우 적어진다.

참고자료

· N Saitou M Nei(1987), The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees, Molecular Biology and Evolution, Volume 4, Issue 4, 1 July, Pages 406–425
· H Zhu, F Qu, and L H Zhu(1993), Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride, Nucleic Acids Res, Nov 11; 21