분자생물학 실험] Plasmid DNA isolation & purification

목차

1.Date
2.Title
3.Purpose
4.Introduction
5.Material
6.Method
7.Result
8.Discussion
9.Reference

본문내용

2.Title : Plasmid DNA isolation & purification
3.Purpose : E.coli를 lysis시켜 Plasmid DNA를 분리시키고 정제한다.
4.Introduction
①Alkaline lysis method
Bimboim, Doly에 의해 1979년 고안된 방법으로, 세균의 세포벽과 세포막을 부수고 DNA만 분리해내는 방법으로 염색체 DNA와 Plasmid DNA를 구분하여 분리해야 하는 실험이다. 하지만 염색체 DNA와 Plasmid DNA 모두 DNA이므로 구분하여 분리하기 쉽지 않기 때문에 크기의 차이를 이용하여 분리해야 한다. 염색체 DNA는 Plasmid DNA에 비해 크기가 매우 크므로, 이러한 성질을 이용하여 분리한다. 극한 pH변화 조건에서 supercoiled plasmid는 변성된 후 renaturation이 되지만 그렇지 못한 염색체 DNA는 renaturation이 되지 못하고 agregation되기 때문에 Plasmid DNA를 분리해낼 수 있다.

●solution1 - resuspension solution
:세포벽을 파괴하지만 삼투압을 유지시킴으로써 세포의 외형을 유지하며 염색체 DNA를 보호한다.
-Glucose : 급격한 lysis로부터 세포막 안정
-Tris-Cl : pH 8.0으로 맞춰줌
-EDTA : 세포벽의 Ca²⁺를 제거해주고 DNase 불활성화
●solution2 - lysis solution
:세포막을 파괴하고 pH를 높여 Plasmid DNA와 단백질을 변성시킨다.
-SDS : 계면활성제, Cell lysis
-0.2M NaOH : 급격한 pH변화로 DNA와 단백질 변성
●solution3 - Neutralization solution
:pH를 낮춰 염색체 DNA와 Plasmid DNA를 재생하는데 크기가 큰 염색체DNA는 엉기는 반면 크기가 작은 Plasmid DNA는 정확하게 재생되어 구분 짓게 해준다.

참고자료

· 박철희, 2006, 미생물학실험
· Joanne M. Willey, Linda M. Sherwood, 2012, 미생물학
· 최신 실험 미생물학, 신일상사