DNA cloning of the T4 DNA ligase gene and expression of the protein n in E. Coli

목차

1. Introduction
2. Materials
3. Experimental Procedure
4. Results & Discussion
5. Conclusion & Opinion
6. Reference

본문내용

Gene cloning은 세포 내 특정 DNA sequence를 분리하고 이를 복제하여 여러 개의 copy를 얻는 과정이다. 본 실험에서는 bacteriophage T4 DNA ligase protein을 얻기 위하여 E.coli를 이용하여 T4 DNA ligase gene(크기 1464base)를 cloning하였다. 더불어 T4 ligase를 발현, 효소의 활성을 측정하였다. DNA ligase는 특별한 타입의 ligase로써 DNA 복제 및 수복 때 2중 나선 중 한쪽 사슬의 절단부인 3`-hydroxyl end와 5`-phosphate end를 covalnet phosphodiester bond로 결합시키는 효소이다.
Bacteriophage T4 DNA ligase는 Bacteriophage T4로부터 추출된 DNA ligase로써, 68kDa의 single polypeptide (pI = 6.0–6.2)이다. 이는 3’-OH와 5’-phosphate termini를 가진 DNA molecule의 연결 반응을 촉매하며, DNA, RNA, DNA-RNA hyprid duplex의 blunt end와 sticky end, nick을 모두 연결한다. 이는 dsDNA end간의 연결뿐만 아니라, dsDNA내의 single-strand nick을 repair하는 반응도 촉매 한다. pH 7.5~8.0에서 최대 활성을 보여주며, 활성을 위해 ATP와 Mg2+ (10mM에서 최대활성)가 필요하다. Sulfhydryl reagent(DTT, 2-mercaptoethanol) 또한 요구되며, 200mM이상의 NaCl에 의해 활성이 떨어진다. DNA ligation은 Molecular biology에서 다양하게 쓰이는 반응으로 특히 blunt end ligation 반응 촉매 능력이 우월한 T4 DNA ligase는 실험실에서 많이 쓰이는 효소 중 하나이다. 따라서 이러한 T4 DNA ligase를 cloning 하여 expression할 수 있다면 매우 실용적일 것이며 이 실험은 gene cloning 과정에 의해 생산된 T4 DNA ligase의 enzyme activity를 측정함으로써, 이러한 실용성을 검증하는 것을 목표로 했다.

참고자료

· MURRAY, N., BRUCE, S., AND MURRAY, K.: MOLECULAR CLONING OF DNA LIGASE GENE FROM BACTERIOPHAGE T4. JOURN. MOLEC. BIOL., 132, 493 (1979).
· WEISS, B., JACQUEMINSABLON, A., LIVE, T., FAREED, G., AND RICHARDSON, C.: ENZYMATIC BREAKAGE AND JOINING OF DEOXYRIBONUCLEIC ACID. VI FURTHER PURIFICATION AND PROPERTIES OF POLYNUCLETOIDE LIGASE FROM ESCHERICHIA COLI INFECTED WITH BACTERIOPHAGE T4. J. BIOL. CHEM., 243, 4543 (1968).
· ROSSI, R., MONTECUCCO, A., CIARROCCHI, G., AND BIAMONTI, G.: FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF THE T4 DNA LIGASE: A NEW INSIGHT INTO THE MECHANISM OF ACTION , NUCLEIC ACIDS RES 25, 2106, 1997
· BLABER M. 1998 SPRING. WEB PAGE FOR LECTURE 25 OF MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY COURSE: PROKARYOTIC EXPRESSION VECTORS. ACCESSED 2003 FEB17.
· UNGER TF. 1997. SHOW ME THE MONEY: PROKARYOTIC EXPRESSION VECTORS AND PURIFICATION SYSTEMS. THE SCIENTIST 11(17). ACCESSED 2003 FEB 17
· http://www.fermentas.com/catalog/modifyingenzymes/t4dnaligase.htm
· Modern Experimental Biochemistry 3rd edition, Rodney Boyer, Benjamin Commings, page 43, 44
· http://genehunters.co.kr/Training/0122.htm, 유전단백체 기능제어 연구센터, 2005