결과.Plasmid purification

최초 등록일
2013.05.09
최종 저작일
2011.10
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목차

1. 실험제목
2. 실험목적
3. 실험방법
4. 실험결과
5. 실험고찰
6. 참고문헌

본문내용

1. 실험제목
Plasmid purification (Mini-prep)

2. 실험목적
연구실에서 많이 사용되는 일반적인 방법으로 E. coli에서 plasmid DNA를 순수 분리하고 분자량을 측정해 본다.
plasmid에 관해 학습하고 vector로써의 활용도에 대해 이해한다.

3. 실험방법
-Modified alkaline lysis method
1)Culture를 5ml뽑아서 튜브에 담고 1분 동안 centrifuge 하여 cell을 모은다.(cell down)
2)상층액을 버리고 Sol.1 250ul을 넣어 파이펫으로 resuspend시킨다. Sol.1은 EDTA를 첨가하여 cell wall의 Mg2+를 chelating 함으로써 cell wall을 깨지기 쉬운 상태로 만들어 주되 cell이 깨지지 않게 하기 위해 glucose로 삼투압을 유지시켜 준다. 그러므로 cell이 용액에 고루고루 영향을 받을 수 있도록 완전히 suspension시킨다.
-sol.1(resuspension buffer) : 50mM glucose, 20mM Tris-HCL (pH8.0), 10mM EDTA, RNase1
3) 250ul의 sol.2를 넣고 inverting으로 섞어준다.
-sol.2(lysis buffer) : 0.2N NaOH (pH12), 1%SDS
4) 350ul의 sol.3을 넣고 inverting으로 섞어준다.
-sol.3(neutrilization buffer) : 5M potassium acetate, 5M acetic acid
* 3,4과정은 DNA를 denaturation시키는 핵심적인 과정인데, chromosomal DNA는 분리된 DNA 단편들이 완벽하게 다시 붙지 않고 서로 엉키게 되어 무게를 가짐으로써 침전이 되고 plasmid는 일부분만 분리되어 다시 정상적으로 붙어서 원심분리 시 상층액에 남게된다. 하지만 이때 voltexing등으로 너무 세게 흔들게 되면 추후 chromosomal DNA가 너무 작게 분해되어 유출 될 우려가 있으므로 주의하여서 inverting해야 한다.

참고 자료

http://www.genehunters.co.kr/Training/01_3_3.htm (유전단백체 기능제어 연구센터)
http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_20.php (연세대학교 의과대학 생화학-분자생물학교실)
생명과학대사전, 강영희, 2008, 아카데미서적
생명과학, Campbell·Reece, 전상학 역, 2008, 월드사이언스

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