[생화학 실험보고서] Sub 클로닝, DNA의 제한효소 이용한 절단, ligation, elusion

소개

preparation한 DNA를 restriction enzyme을 이용하여 절단하고 gel electrophoresis를 통해 size를 확인한다. 원하는 size의 DNA를 다시 Gel로부터 얻어내어 vector와 ligation하고 이를 확인하는 실험입니다.

목차

1. 목적
2. 원리
3. 시약 및 기자재
4. 실험방법
5. 실험결과
6. 고찰
7. 참고문헌
8. 추가문제

본문내용

1. 목적
전 주에 preparation한 DNA를 restriction enzyme을 이용하여 절단하고 gel electrophoresis를 통해 size를 확인한다. 원하는 size의 DNA를 다시 Gel로부터 얻어내어 vector와 ligation하고 이를 확인한다.


2. 원리
1) Restriction enzyme digestion
제한효소(restriction enzyme)는 DNA 분자내의 특정한 염기서열을 인식하고, 인식한 서열 내, 혹은 근처의 특정한 부위에서 double stranded DNA를 절단하는 균주 특이성이 있는 endonuclease이다. 이것은 세포 내로 침입해오는 virus나 외래의 DNA를 절단하여 제거하는 bacteria의 자기방어기구로 존재한다. Bacteria는 자신의 DNA에서 인식절단 부위의 염기를 methylation시키기 때문에 자신의 제한효소 작용으로부터 보호된다.

1-1) 제한효소의 종류
Type Ⅰ enzyme은 3개의 서로 다른 subunit R, M, S (restriction, methylation, sequence recognition을 담당)로 구성되어 있다. Target site가 S subunit에 의해서 인식되면 DNA와 결합한 enzyme은 곧이어 restriction이나 modification을 시킨다. Cleavage는 enzyme이 인식하는 특정한 recognition sequence로부터 >1000 b.p 떨어진 nonspecific site에서 일어난다(두 strand 모두 methylation 안된 경우만 자름). Mg2+, ATP, S-adenosylmethionine이 존재할 때만 enzyme activity가 존재한다(DNA dependent ATPase 역할을 함). 6-methyl adenine residue를 만드는 site-specific mehtylase 역할도 한다.
※ 1. Recognition site : bipartite and asymmetrical (e.g. TGAN8TGCT)
2. Cleavage site : nonspecific > 1000 b.p from recognition site
3. ATP needed for restriction ? : yes
Type Ⅱ restriction / methylation system은 nucleotide의 특정한 sequence를 자르는 restriction endonuclease와 이러한 특정 sequence를 변형시키는 methylase로 구성되어 있다.

참고자료

· 없음