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Vector ligation, C-Cell preparation, Heat Shock을 이용한 대장균의 Transformation 및 Transformation Selection

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최초등록일 2011.08.04 최종저작일 2011.06
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Vector ligation, C-Cell preparation, Heat Shock을 이용한 대장균의 Transformation 및 Transformation Selection
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    소개

    이 실험은 정제된 PCR 결과물을 가지고, Vector ligation 시키고 C-cell을 이용해서 형질전환을 시킨다. 그다음에 재조합된 형질전환체를 선별하여, 배양시키고 여기에서 재조합된 플라스미드 DNA만을 알칼리 lysis법을 이용해 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA에 우리가 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지 확인하기 위해 우리는 EcoR1 으로 절단해서 전기영동을 시켰다.

    목차

    1. 실험개요
    2. 실험내용 및 결과분석
    - Vector ligation
    - C-Cell preparation
    - Heat Shock을 이용한 대장균의 Transformation 및 Transformation Selection
    - 형질전환체 확인; 박테리아 배양 및 recombinant plasmid DNA 분리
    - 제한효소 절단(EcoR1 cutting)
    - Discussion

    본문내용

    1. 실험개요
    이번 실험은 정제된 PCR 결과물을 가지고, Vector ligation 시키고 C-cell을 이용해서 형질전환을 시킨다. 그다음에 재조합된 형질전환체를 선별하여, 배양시키고 여기에서 재조합된 플라스미드 DNA만을 알칼리 lysis법을 이용해 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA에 우리가 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지 확인하기 위해 우리는 EcoR1 으로 절단해서 전기영동을 시켰다.

    2. 실험내용 및 결과분석
    - Vector ligation
    PCR 은 Taq Polymerase를 사용하기 때문에 PCR 결과물은 3‘말단 쪽에 A를 하나 더 가지게 된다. 이는 Taq Polymerase가 DNA의 3’말단 쪽에 A를 하나 더 붙이기 때문이다. 따라서 PCR 결과물은 Blunt end 가 아니다. 만약 DNA Polymerase Ⅲ가 DNA를 합성했다면 양 말단이 Blunt end 였을 것이다.
    때문에 Vector에 ligation 시키기 위해서는 PCR product를 Blant end 로 만들어 주거나 아니면 Vector 자체를 끝에 A와 상보적인 T를 가진 것을 사용해야 한다.
    이번 실험은 Vector 자체를 말단이 T인 것을 사용하였다. pGEM-T Easy vector를

    참고자료

    · 없음
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