Plasmid DNA 분리

소개

Plasmid DNA 분리

목차

Theme
Date&name
Abstract
Method
Principle
Results
Discussion
References
질문
1.분리한 plasmid인 pBluescript SK(+)의 구조(plasmid map)
2.Plasmid 분리에서 사용된 용액의 각 선분의 역할
3.Plasmid DNA 분리의 원리
4.Plasmid DNA 분리의 윈리와 genomic DNA 분리 원리에 있어서 차이점
5.Genomic DNA 순도 계산법, 정량 계산법

본문내용

Plasmid DNA를 분리하기 위하여 이번 실험을 하였다. Plasmid DNA를 분리하는 방법은 다양하지만 모두가 기본적인 3과정을 포함하고있다. 첫번째로 미생물 배양에 의한 plasmid의 증폭 두번째로 미생물 수집과 세포 용균 세번째로 plasmid의 정제이다.
Method(실험방법)
5ml LB broth가 들어있는 test tube에 plasmid pBluescript SK(+)를 가지고 있는 E. coli를 37℃ shaking incubator(진탕기)에서 하룻밤 키웠다 그리고 1.5ml tube에 배양액 1.5ml넣고 원심분리한 후(최대속도, 30초), 상등액은 버리고, 다시 tube에 배양액 1.5ml을 넣고 원심분리하고 상등액은 버렸다.(총 3ml). 5초간 원심분리한 후 micropipet을 사용하여 tube 속에 남아 있는 액체를 최대한 제거하고 tube에 Solution-1을 100ul 넣고 tube 아래를 손가락으로 여러 번 쳐서 pellet 상태의 박테리아 세포를 완전히 녹인 후 Solution-2를 200ul 넣고 tube 를 10회 정도 뒤집어서 잘 섞었다(이 과정에서 Solution-2 안에 있는 SDS와 NaOH로 인해 세포가 완전히 부숴지면서 단백질이 변성되게 된다. 이 상태에서 5분 이상을 넘기지 않도록 한다.) 5초간 원심분리 한 후 Solution-3을 150ul 넣고 10회 정도 뒤집어서 잘 섞고 (이 과정은 Solution-2에 들어있던 NaOH를 중화시키면서 plasmid를 제외한 모든 세포물질을 침전시키는 과정이다.) 최대속도로 10분간 원심분리하고 상등액을 새로운 1.5ml tube에 옮긴 후 100% ethanol 1ml을 tube에 더 한 후 뒤집기를 10회 정도 반복하여 잘 섞고 냉동실에 20분간 보관 하였다. 그리고 15분간 최대속도로 원심분리하고 상등액을 버리고 다시 5초간 원심분리한 후 micropipet으로 바닥에 고인 모든 액체를 완전히 제거하고 70% ethanol 0.5 ml 을 넣고 부드럽게 thube 안쪽 벽면을 적셨다.(tube의 벽면에 남아있는 salt를 씻 5분간 원심분리하고 상등액을 버리고 다시 5초간 원심분리 한 후 micropipet으로 바닥에 고인 모든 액체를 완전히 제거 한고 incubator 안에서 뚜껑을 열어 놓고 20분정도 건조시켰다 그리고 100ul TE buffer를 tube에 넣어 DNA가 녹게 했다.

참고자료

· 없음