MTT assay (cell viability test) 실험 리포트

소개

동물 세포인 CHO cell을 가지고 MTT assay를 하여 쓴 리포트. 원리, 방법, 결과, 고찰 등 수록.

목차

1. Principle
2. Meterial and method
3. Result
4. Discussion
Reference

본문내용

1. Principles
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)는 노란색 수용성 물질로서 세포 내에서 미토콘드리아의 hydrogenase에 의해 자주색의 비수용성 MTT formazan으로 환원된다. 비수용성 결정을 이루는 MTT formazan은 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 의해 용해될 수 있다.
그림 1 . MTT tetrazolium is reduced to MTT formazan by mitochondrial hydrogenase (reductase)
Luminometer 또는 ELISA reader의 540nm ~ 570nm의 빛에서 MTT formazan의 흡광도를 측정하여 살아있는 세포의 농도를 추정하여 생존율을 알아낼 수 있다. 일반적으로 96 well plate에 배양된 세포를 각기 다른 농도의 시험 물질로 처리하고 생존율을 알아보는데 이 방법을 사용한다.
2. Materials and methods
1) CHO cell을 5x104 cell/mL까지 tissue culture plate에서 배양한 후 trypsin을 이용하여 회수.
2) 96 well-plate에서 serum-free DMEM 배지 및 시험물질 (0 ~ 10% of yeast hydrolysate and H2O2)이 첨가된 배지에 세포를 각각 25,000 cells/well의 농도로 접종하여 24시간 배양(37℃, 5% CO2).
3) 배양 후 배지를 제거하고 warm



4. Discussion
효모의 가수분해물은 효모의 종류에 따라 그 성분이 조금씩 다르지만 일반적으로 세포 배양 시 풍부한 질소원이 될 수 있고, 또한 아미노산, 펩톤, 탄수화물, 비타민 등이 함유되어 있기 때문에 세포 증식을 촉진한다고 보고되어있다. H2O2의 경우 세포 내에서 강한 산화제로 작용한다고 알려져 있다. 또는 세포 내에 중금속이 존재할 시 다음과 같은 두 단계의 Fenton reaction이 일어나 free radical 또는 ROS (reactive oxygen species)을 형성하고 이것은 alcohol, ketone, carboxylic acid, amine, phosphorous 등을 지닌 분자들과의 반응성이 매우 높다.
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH· + OH
H2O2가 ROS로 변환되기 전에 세포 내의 막성 소기관인 peroxisome에서 catalase에 의해 물로 변환되어 독성을 중화시킬 수 있지만, 많은 양의 peroxide가 존재할 경우 peroxisome의 독성 중화 능력을 초과하게 되어 ROS가 형성되고 이는 결국 세포 사멸을 일으킨다고 보고되어있다.
MTT assay 결과 yeast hydrolysate

참고자료

· 없음