HIC(hydrophobic interaction chromatography)와 TAP(tandem affinity chromatography)

소개

안녕하세요 현재 생명공학과에 재학중인 학생입니다
생명공학 연구방법론이란 교과목에대한 과제를 한 것입니다
HIC(hydrophobic interaction chromatography)와 TAP(tandem affinity chromatography) 에 대해 조사한 것입니다.
특히 뒤에 있는 TAP 방법은 이방법을 사용한 논문을 바탕으로
그 실험목적, 방법, 결과를 정리해 놓았습니다~

목차

1. chromatography를 적용하여 ‘초록이’ 단백질을 대장균 extract에서 분리하였다. 다음은 이 때 적용한 chromatography에서 사용한 buffer이다. 사용한 buffer를 기반으로 어떤 chromatography를 적용하였는지 유추하시오. 그렇다면 이 chromatography는 ‘초록이’단백질의 어떤 특징을 이용하였겠는가?
2. `tandem affinity purification(TAP)`에 대하여 조사하고 이 방법을 적용한 논문을 선택하여 이 방법을 적용한 목적, 실행한 실험방법, 그리고 결과를 요약하시오.
- TAP 방법을 적용한 논문 -

본문내용

Equilibration Buffer-A high salt buffer (2M (NH)SO)
Binding Buffer-A very high salt buffer (4M (NH)SO)
Wash Buffer-A medium salt buffer (1.3M (NH)SO)
Elution Buffer-A very low salt buffer (10mM Tris/EDTA)


염도가 상대적으로 높지 않은 Equilibration buffer를 사용해서 ‘초록이’단백질이 소수성 결합을 하는 column에 붙을 수 있는 평형 상태를 유지시켜주는 것이다. 결정적으로 ‘초록이’단백질이 column 속에 붙을 수 있는 것은 염도가 높은 buffer에서 단백질의 삼차구조가 바뀌면서 단백질이 갖는 소수성 부위를 더...


TAP 기술은 단백질-단백질 사이의 상호관계(interaction)를 조사할 때 사용된다. 이 기술을 통해서 원하는 조각으로 융합단백질을 만들고 TAP-tag를 마지막 부위에 붙이는 것이 가능하다. TAP-tag 방법은 Saccharomyces cerevisiae라는 미생물로부터 얻은 한 복합체를 이용하여 높은 순도로 순수한 단백질 복합체를 분리해 내고자 할 때 사용된다. TAP-tag는 두 개의 높은 친화성을 같은 염기서열, 단백질 A, calmodulin결합서열(calmodulin binding peptide(CBP)을 포함하고, 이 TAP-tag는 TEV-protease에 대한 특이성이 높은 절단부위에 의해 나뉘어진다. 또한 TAP-tag는 선택된 단백질의 N 혹은 C 말단에 첨가되어 지게 된다. 세포가 자라고 용해되면, TAP-tagged 단백질과 주변 단백질들은 강하게 친화적으로 IgG 항체가 붙어있는 유리구슬에 결합하게 된다. 이후 TEV-protease를 처리해주면 복합체가 방출되고, 방출된 복합체는 Calmodulin이 붙어 있는 유리구슬에 결합하게 된다. 이렇게 결합되어 있는 복합체는 EGTA를 처리해 줌으로써 용리되게 된다.

참고자료

· Bernd Schimanski, Tu N. Nguyen, and Arthur Gunzl. 2005. Highly Efficient Tandem Affinity Purification of Trypanosome Protein Complexes Based on a Novel Epitope Combination. Eukaryotic Cell, Now. 2005, p. 1942-1950