효소반응 속도론 (enzyme kinetics)와 저해제 실험 리포트

소개

Alcohol dehydrogenase의 효소 반응 속도론 (enzyme kinetics), 미카엘리스 멘텐 방정식 (Michaelis-Menten equation), Lineweaver-Burk plot을 구하고 경쟁적, 비경쟁적, 불경쟁적 저해제인지 알아보는 실험. 분광광도계 사용법 등이 포함된 실험 리포트 입니다.

목차

1. 실험목적
2. 원리 및 이론
1) Enzyme kinetics
2) Michaelis-Menten equation
3) Lineweaver-Burk plot
4) Enzyme inhibition
5) 분광광도계의 원리
3. Reagent
1) Yeast alcohol dehydrogenase
2) Enzyme assay buffer
3) Substrate : ethanol
4) Inhibitor4 : 4-methylpyrazole (fomepizole)
4. Method
5. Result
6. Discussion

본문내용

1. 실험목적
Yeast alcohol dehydrogenase의 Km, Vmax를 구하고 inhibitor를 첨가한 후 Km, Vmax의 변화를 관찰하고, inhibition의 방식을 구한다.
2. 원리 및 이론
1) Enzyme kinetics
효소는 촉매 되는 반응의 속도를 변화시킨다. 일반적으로 알려진 거의 대부분의 효소는 단백질이고 소수의 RNA 분자들(ribozyme)도강력하다. 효소들은 반응속도를 수십억 배 이상 촉진시킨다.
대부분의 효소 촉매 반응들은 효소가 없으면 거의 반응이 진행되지 않는다. 효소의 반응회전수(turnover number)는 효소의 촉매력을 나타내며, 이의 정의는 초당 한 효소분자에 의해 기질에서 산물로 전환되는 숫자를 말한다. P의 반응에서 반응속도를 A의 농도의 함수로 작도하면 직선을 얻으며 그 기울기는 속도상수 k가 된다. 즉, A가 많을수록 반응속도 v는 커진다.
오직 하나의 기질만을 포함하는 효소-촉매반응에 대하여 같은 분석을 하면 그 결과는 크게 달라진다. 기질



6. Discussion
Alcohol dehydrogenase에 의한 효소 반응에서 기질인 에탄올과 NAD+는 1:1로 반응하므로 에탄올의 산화물인 아세트알데히드 대신, NADH의 흡광도를 측정하여 반응속도 v를 구할 수 있었다. 기질의 농도가 점차 증가함에 따라 생성물의 양(δ[P])도 증가함을 볼 수 있었고, 기질의 농도를 800 mM까지 증가시켰지만 최대속도 Vmax의 plateau를 Michaelis-Menten plot에서 볼 수는 없었다. 저해제 없이 효소 반응을 하였을 대략적으로 직선화하여 얻은 Lineweaver-Burk equation에서 산출한 효소 반응의 최대속도는 1,000 μM/min이었고 Km은 166.7 mM 이었다. 그러나 Michaelis-Menten plot에서 [S] = 166.7 mM을 대입해보면 대략 Vmax/2 = 380 μM/min이어서 Vmax는 약 760 μM/min이어야 하나, 관찰된 Michaelis-Menten plot 상의 plateau가 없어서 Vmax를 정확히 알 수 없었고 Lineweaver-Burk plot과의 연관성과 실험 결과의 유의성은 크지 않았다고 보여진다. Michaelis-Menten plot의 기울기가 들쭉날쭉한 것으로 보아 실험 진행 시 효소 반응의 조건이 의도한대로 이루어지지 않았던 것으로 추정된다.

참고자료

· 1. 구자현 외, 의학생화학, pp81-104, 정문각, 2001
· 2. 실험생화학, pp53-72, pp235-238, 탐구당, 2004
· 3. Hans Bisswanger, Enzyme Kinetics: Principles and Methods, pp228-236 Sons, 2008