Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS - Minipreparation

소개

이번 실험에서는 plasmid DNA를 추출하기 위한 Miniprep 중에서 가장 보편적으로 사용되는 alkaline lysis method을 사용했다. 실험의 기본적인 원리는 세균의 세포벽과 세포막을 부수고 DNA만을 분리하는 것이며, 이 때 중요한 점은 세균이 갖고 있는 염색체 DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이었다.
SolⅠ으로 염색체 DNA는 파괴되지 않도록 세포를 유지시키면서 세포벽을 파괴하고, 삼투압을 유지시켜 세포의 외형은 유지해 주었다. SolⅡ은 세포막을 깨고 pH를 높여 염색체 DNA와 plasmid DNA, 단백질을 변성시켜주었고, SolⅢ은 높은 농도의 salt과 아세트산으로 pH를 낮춰 염색체 DNA와 plasmid DNA를 재생시켜주었다. Phenol:Chloroform extraction 으로 남아 있는 단백질 찌꺼기를 제거하였고, 100%와 70% Ethanol을 이용하여 DNA를 precipitation시키고 소량의 salt도 제거하였다. plasmid에 no treatment와 RNase treatment 처리를 하여 RNase로 인한 RNA band의 유무를 알 수 있었고, single cut 및 double cut DNA band로 plasmid DNA가 맞는지 알아보고자 하였다. 또한 supercoiled DNA와 open circular DNA를 비교해보았다.

목차

Abstract:
Introduction:
Materials & Methods:
Result:
Discussion:
Reference:

본문내용

Abstract:
이번 실험에서는 plasmid DNA를 추출하기 위한 Miniprep 중에서 가장 보편적으로 사용되는 alkaline lysis method을 사용했다. 실험의 기본적인 원리는 세균의 세포벽과 세포막을 부수고 DNA만을 분리하는 것이며, 이 때 중요한 점은 세균이 갖고 있는 염색체 DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이었다.
SolⅠ으로 염색체 DNA는 파괴되지 않도록 세포를 유지시키면서 세포벽을 파괴하고, 삼투압을 유지시켜 세포의 외형은 유지해 주었다. SolⅡ은 세포막을 깨고 pH를 높여 염색체 DNA와 plasmid DNA, 단백질을 변성시켜주었고, SolⅢ은 높은 농도의 salt과 아세트산으로 pH를 낮춰 염색체 DNA와 plasmid DNA를 재생시켜주었다. Phenol:Chloroform extraction 으로 남아 있는 단백질 찌꺼기를 제거하였고, 100%와 70% Ethanol을 이용하여 DNA를 precipitation시키고 소량의 salt도 제거하였다. plasmid에 no treatment와 RNase treatment 처리를 하여 RNase로 인한 RNA band의 유무를 알 수 있었고, single cut 및 double cut DNA band로 plasmid DNA가 맞는지 알아보고자 하였다. 또한 supercoiled DNA와 open circular DNA를 비교해보았다.

Introduction:
Miniprep은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다. 이 Miniprep에는 여러 가지 방법이 있지만, 보편적으로 사용되는 방법은 Alkali lysis method이다. Alkali lysis method의 기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것인데, 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. 하지만 다행히 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하여 분리할 수 있다. Alkali lysis method의 핵심 과정은 먼저 세포막을 유지하면서 세포벽을 깬다. 세포벽을 무너뜨리는 물질은 EDTA

참고자료

· - 박상대, 분자세포생물학, 1998, 아카데미서적, pp.24~25
· - David Ferrfelder, 분자생물학, 1989, 아카데미서적, pp.123~124
· - www.google.co.kr