연세대학교 생화학실험(2) - Protein Overexpression in E. coli and Purification by Affinity Chromatography

소개

E.coli에서 overexpression된 단백질을 purification해 보고, 각 step의 용액 속의 단백질 양을 SDS-PAGE를 이용하여 추측해본다. 결과를 보고 각 step의 중요성과 loss의 정도를 확인한다.

목차

◆ 실험일자
◆ 제출자
◆ 목적
◆ 원리
◆ 시약 및 기자재
◆ 방법
◆ 결과
◆ 고찰

본문내용

◆ 목적.
E.coli에서 overexpression된 단백질을 purification해 보고, 각 step의 용액 속의 단백질 양을 SDS-PAGE를 이용하여 추측해본다. 결과를 보고 각 step의 중요성과 loss의 정도를 확인한다.

◆ 원리
<E.coli에서 단백질 발현의 특징>
E.coli 배양은 값이 싸고 쉬우며, E.coli를 이용하면 원하는 protein을 높은 수준으로 얻을 수 있다. 하지만 E.coli에서는 post-translational modification이 일어나지 않으므로 glycosylation이나 disulfide bond, cleavage 등이 일어나지 않는다.

<lac operon 조절>
lac operon 앞에는 inducer와 promoter가 존재하는데, inducer는 lac operon을 조절하는 lac repressor를 coding하고 있다. inducer에서 발현된 lac repressor는 lactose가 없을 때, lac operon의 operator에 붙어서 발현을 저해하고, lactose가 존재하면, repressor에 lactose가 binding하여 repressor가 operator에 붙지 못하게 하고, operator가 자유로워지면, lac operon이 turn on 되어 발현되기 시작한다. 이 때, IPTG는 lactose의 analog로, lactose가 없어도 lactose대신 repressor에 붙어서 repressor가 operator에 붙지 못하게 한다.



<Two-step expression vector system>
bacterial chromosome의 lac operon에 T7 RNA polymerase의 gene을 끼워넣고, plasmid(pET-32a+ vector)에 T7 promoter로 유도될 수 있도록 원하는 단백질의 gene이 있으면, lactose나 IPTG로 bacterial chromosome의 lac operon이 turn on 되어 T7 RNA polymerase가 발현되고, 이 발현된 RNA polymerase가 vector의 T7 promoter부터 mRNA를 만들어서 원하는 단백질이 발현된다.

참고자료

· - 생화학실험(2) 실험교본, 연세대 생화학과.