분자생물학 실험2

소개

분자생물학 실험수업에서 제출한 레포트입니다.

목차

실험6. Transformation of the Competent E. coli cell
실험7. Small scale plasmid 분리 & Selection (Screening)
실험8. PCR (polymerase chin reaction)
실험9. SDS-PAGE
실험10. Western blot

본문내용

실험6. Transformation of the Competent E. coli cell
⓵요약
Transformation(형질전환)이란 DNA를 bacteria 세포 내로 주입하여 새로운 유전형질을 추가로 갖게 하는 것이다. 오늘 실험을 통해 지난 주 ligation한 DNA를 Competent E. coli cell에 주입시켜 형질전환된 colony를 배양한다.
⓶서론
Transformation
형질전환은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 일을 말하며, 수용세포에 노출된 DNA가 흡수, 통합, 발현되는 과정으로 몇몇의 박테리아 사이에서 자연적으로 일어나는 현상이다. 다당류로 이루어진 두꺼운 막, 즉 협막을 가진 S형 균으로부터 DNA를 추출하여 이것을 다당류성 협막을 가지지 않은 R형 균에 작용시키면 R형 균의 일부가 S형 균으로 변한다. 이것은 S형 세균의 DAN가 R형 세균 속에 들어가서 유전자 발현을 하기 때문이다. 전환을 일으키는데 필요한 DNA의 최소량은 약 10만분의 1mol이며, DNA의 single strand를 주는 것보다도 double strand를 주는 쪽이 전환을 일으키기 쉽다. 대장균을 포함한 다른 종은 외부DNA를 흡수할 능력이 없다. 이러한 한계점을 극복하기 위해서 수용세포로 DNA를 삽입하기 위한 인공적인 방법이 고안되었고 수많은 실험생물에 적용되었다. ...





결과 및 토론
오른쪽은 암실에서 membrane을 필름에 현상
시킨 것으로 X-ray에 오래 두어 필름이 타서
membrane band가 잘 보이지는 않는다.
gel의 단백질을 PDVF membrane으로 transfer하는
이유는 transfer 과정 없이 antibody와 반응시킨 25kDa
다면 antibody가 gel안으로 쉽게 이동하지
못하기 때문에 필수적인 과정이다.
TBST buffer는 washing 작용을 하며, Skim milk는
protein외의 다른 물질은 발색시키지 않고
단백질만을 blocking시키는 역할을 한다.
이 단백질에 항체(primary Ab)를 결합시키고
그 위에 발색을 띄게 하는 항체(secondary Ab)를
결합시켜 X-ray 필름에 현상시키면 1차로 사용한
항체에 대한 항원 단백질이 그 추출물 내에 얼마나 존재하는지를 알 수 있다.
gel에서 PDVF membrane으로 transfer시킨 후 PDVF를 보니 protein이 위치하는 곳에 하얗게 band가 생겨있었고, 암실에서 현상한 필름을 developer buffer에 담가 발색시킬 때 band가 점점 짙게 나타났다. 필름을 현상할 때 위에서 보이듯이 원하는 부분은 검고, 불필요한 부분은 푸른색을 나타낸다고 한다.
지난시간에는 단백질의 folding구조를 파괴하고, SDS를 이용해 전기영동하여 단백질의 분자량을 알아봄으로서 단백질의 발현을 확인하였고, 오늘실험에서는 SDS-PAGE한 gel을
membrane으로 transfer하여 항원항체반응으로 단백질의 발현을 알아보았다.

참고자료

· 연세대학교 의과대학 생화학-분자생물학교실 및 유전과학연구소 홈페이지
· http://www.ajou.ac.kr/.../western/western%20blot.htm
· http://biopedia.org/index.php/Western_Blotting